含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建*

李一帆，崔柳青，韩 康，薛乐勋#

1)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室 郑州 450001 2)河南工业大学生物工程学院 郑州 450001

叶绿体基因工程是高效表达外源蛋白的有效途径之一，与核转化相比，其具有基因拷贝数多、表达率高、遗传性状稳定、能够避免基因沉默等明显的特点[1]。翻译效率是决定表达能力的关键因素，一些翻译增强序列能明显提高重组蛋白的表达[2]。T7噬菌体基因10前导序列(UUAACUUUA)已经被证实在大肠杆菌中可以作为一种翻译增强序列来提高翻译效率，但是还未见在植物和藻类中的报道[3]。Lux Ct是以荧光素酶基因Lux AB为基础进行适当改造而成，含有高效的内源性atpA基因启动子及5’UTR和3’UTR[4]。Mayfield等[5]用 atpA启动子-atpA 5’UTR-gfp基因-rbcL3’UTR组合表达盒在莱茵衣藻叶绿体中成功表达了绿色荧光蛋白。Canstatin是近年来新发现的一种血管生成抑制因子，它通过诱导内皮细胞凋亡而抑制肿瘤生长[6]。在该研究中，作者尝试构建一种含有翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体，以期为进一步研究外源蛋白在杜氏盐藻叶绿体中的表达打下基础。

1 材料与方法

1.1菌株、质粒、载体和主要试剂Lux Ct质粒由SP Mayfield 馈赠，大肠杆菌DH5α为该研究室保存，PMD18-T载体购自大连宝生物(TaKaRa)公司，限制性内切酶PaeR7Ⅰ、SphⅠ购自NEB公司，LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、AMP、IPTG和X-GAL均购自TaKaRa公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，AMV First Strand cDNA Synthesis 试剂盒购自Fermentas公司，DNA片段胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3人canstatin基因的RT-PCR扩增采用Trizol试剂提取法提取人非小细胞肺癌A549细胞总RNA，以获得的RNA为模板，用AMV First Strand cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA 的第一链。以反转录产物进行PCR扩增，扩增不添加翻译增强序列的人canstatin。扩增在5’UTR 下游添加翻译增强序列的人canstatin时所用引物为canstatin F1和canstatin R；扩增在3’UTR上游添加翻译增强序列的人canstatin时所用引物为canstatin F和canstatin R1。反应条件均为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。取20 μL反应产物进行10 g/L琼脂糖电泳，观察结果。

1.4克隆载体PMD18-T/Can的构建及鉴定分别胶回收目的片段，与PMD18-T载体按物质的量的比15于16 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α。蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，提取质粒并进行酶切鉴定。

1.5canstatin叶绿体表达载体的构建及酶切鉴定

用限制性内切酶PaeR7Ⅰ、SphⅠ分别对Lux Ct和PMD18-T/Can进行双酶切，分别回收载体片段和目的片段。利用T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α。挑选单克隆，提取质粒并进行酶切鉴定。

2 结果

2.1未添加及添加翻译增强序列的人canstatin基因片段的扩增结果RT-PCR所得片段约为700 bp，与预期片段大小基本一致(图1)。

图1 人canstatin RT-PCR扩增结果

2.2PMD18-T/Can的酶切鉴定PMD18-T/Can经PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切，得到一条载体片段和一条插入片段，插入片段与回收片段大小一致(图2)。

图2 pMD18-T/Can的酶切鉴定

2.3人canstatin叶绿体重组表达载体的酶切鉴定

Lux Ct质粒经PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切，得到2条片段，小片段大小约为2 100 bp，大片段约为10 000 bp(图3)。将大片段进行回收，与PMD18-T/Can双酶切所得的载体片段连接，得人canstatin叶绿体重组表达载体。该重组质粒经PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切，得到一条载体片段和一条插入片段，插入片段大小约为700 bp，与预期的人canstatin基因大小以及在5’UTR 下游、3’UTR上游添加翻译增强序列的人canstatin基因片段基本一致，表明3个片段均成功插入(图4)。

图3 Lux Ct的酶切鉴定

图4 人canstatin叶绿体重组表达载体的酶切鉴定

3 讨论

在全球范围内人们对药用蛋白的需求量剧增的形势下，天然来源的药用蛋白已经远远不能满足需求。目前，许多蛋白表达系统用于生物制品的生产时都具有一定的缺陷，例如陆生植物已被证明能生产各种生物制品、抗体等，但周期过长[7]。近年来，叶绿体转化技术取得了巨大进步，利用植物叶绿体生产外源蛋白已引起关注，尤其是生产药用蛋白、口服疫苗等[8]。单细胞真核生物杜氏盐藻作为一种理想的生物反应器，含有一个大型的杯状叶绿体。与陆生植物相比，它培养简单、抗逆性佳、生长快并且能够大大减少从最初转化到蛋白表达的时间[9]。这众多优点都使杜氏盐藻具备了成为新型生物反应器来生产外源生物活性物质的巨大潜能。

人canstatin能够有效抑制新生血管形成和抑制肿瘤生长，目前这种被称为“休眠疗法”的肿瘤治疗在临床应用上具有广阔前景[10]。该研究以特异高效启动子atpA构建载体来表达人canstatin基因。并设计利用T7噬菌体g10-L序列在不同位置来提高其表达水平，为建立一个高效表达有活性外源蛋白的叶绿体转化体系打下实验基础。

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