不同浓度氮、磷对杜氏盐藻生长的影响

王 俊，马玉心，崔大练，范彩彩

(浙江海洋学院海洋科学学院，浙江舟山 316000)

微藻作为海洋生态系统中的主要初级生产力，具有生长迅速和对生态环境因子敏感等特点，是研究环境因子对生物胁迫影响的理想模式生物。杜氏盐藻Dunaliella salina是盐藻属的模式种，有较强的抗盐性，是重要的饵料和经济微藻，具有较好的研究和开发利用价值[1]，其营养代谢及生理研究受到越来越多生理生态学家的关注。它们通过光合作用把摄取的无机碳转化为有机物供自身生长需要，也为海洋中其它的鱼类等生物提供了食物[2]。N、P是影响和限制单细胞微藻生长的主要营养盐元素，也是水体富营养化的重要来源[3]。有专家认为c(N)/c(P)=16:1是单细胞藻类维持正常生长和生理平衡最适c(N)/c(P)[4-5]，但由于各种浮游单细胞藻类对营养盐的需求不相同，所需c(N)/c(P)也会受培养环境条件的影响而不同[6]。多种藻类聚集会造成水体富营养化水华或赤潮等现象，促使其异常增殖积累的前提条件是充分的N、P等营养盐[7]，过多的N、P不仅影响藻类的生长还影响水体中养殖的经济水产动物。关于不同N、P营养盐浓度对杜氏盐藻生长影响的研究，目前未见文献报道。通过对不同N、P营养盐浓度对杜氏盐藻生长影响的研究，探讨杜氏盐藻细胞的适宜生长条件，为养殖水体生态环境的保护提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 藻种与培养基

杜氏盐藻由中国海洋大学藻种室提供，试验时取指数生长期的藻液，按1:3进行接种。实验所用海水取自东海沿岸(盐度33，pH 7.5)，经沉淀砂滤、煮沸消毒、静置1 d后备用。实验用培养基为：f/2海水海水培养基，其中的N、P浓度按实验要求添加。

1.2 培养条件

藻种培养用250 mL的锥形瓶，取处于对数生长期的藻种接种，置于光照摇床进行一次性培养，培养温度(25±1)℃，摇床转速100 r/min，培养箱设置光照强度为3 000 lx，光暗比L:D为12 h:12 h。实验用培养基为：f/2海水海水培养基。

1.3 试验设计

以f/2培养基为基础，N、P浓度按试验设计要求添加，N、P浓度分别设置5个水平，每水平2组重复(表1)。添加的氮源为：NaNO3，添加的磷源为：KH2PO4。

表1 氮、磷浓度梯度设置Tab.1 The established gradient of nitrogen and phosphorus concentrations

1.4 生长曲线的测定

每天定时在显微镜下用血球计数板计数，每瓶计数3次，取平均值，记录13 d，以时间为横坐标，每1 mL藻液中的细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

1.5 生长率曲线

生长率的计算公式为：u=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)，其中t1、t2是培养时间；N1和N2分别是培养t1和t2时间的细胞密度[8]。

1.6 数据处理

采用软件SPSS18.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同N浓度下杜氏盐藻的生长曲线

由不同N质量浓度下杜氏盐藻的生长曲线(图1)和生长率可以看出，高质量浓度氮对杜氏盐藻生长的影响最大，对各个N浓度梯度下杜氏盐藻的最大细胞密度均值的统计分析表明，N浓度为0.8、1.0、1.2 g/L时的最大细胞密度与对照组差异极显著(P＜0.01)，而N浓度为0.1、0.4 g/L时两组的最大细胞密度与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。由低到高浓度N实验组中杜氏盐藻指数生长回归曲线方程见表2。不同N质量浓度下杜氏盐藻的生长率K曲线(图2)和生长率K回归指数表明：当N浓度为1.2 g/L时，生长率K下降最快，但各N浓度杜氏盐藻生长率K之间无显著性差异(P＞0.05)。由低到高N浓度中杜氏盐藻生长率K的回归曲线方程见表3。

表2 不同N浓度下杜氏盐藻的生长回归曲线方程Tab.2 The growth regression curve equation of Dunaliella salina under different concentrations of nitrogen

表3 不同N浓度下杜氏盐藻的生长率K回归曲线方程Tab.3 The growth rate regression curve equation of D.salina under different concentrations of nitrogen

图1 不同N浓度下杜氏盐藻的生长曲线Fig.1 The growth curves of Dunaliella salina under different concentrations of nitrogen

图2 不同N浓度下杜氏盐藻的生长率K的变化Fig.2 The variation of growth rate of D.salina under different nitrogen concentrations

2.2 不同P浓度下杜氏盐藻的生长

由图3可知，各实验组杜氏盐藻生长曲线走势相似。当P浓度为0.025 g/L和0.030 g/L时，这两组杜氏盐藻终培养密度值最高，0 g/L时最低。从第7天开始，各组相继进入生长稳定期，当P浓度为0.045 g/L时，稳定期初期的细胞密度最大；第10天时当P浓度为0.025 g/L时细胞密度最大；培养末期时，P浓度为0.025 g/L细胞密度最大。由回归方程的相对生长常数及图3可知，在P浓度为0.025 g/L时，杜氏盐藻最大细胞密度与对照组差异显著(P＜0.05)，在培养末期终细胞密度最大。由低到高不同P浓度下杜氏盐藻生长回归曲线方程见表4。由图4可知，不同N浓度下杜氏盐藻生长率K呈现下降趋势。当P浓度为0.025 g/L时，杜氏盐藻平均生长率K高于其他组，并且下降缓慢，当P浓度为0 g/L时，杜氏盐藻的平均生长率K下降最迅速。不同P浓度下，杜氏盐藻由低到高生长率K的回归曲线方程见表5。

表4 不同P浓度下杜氏盐藻的生长回归曲线方程Tab.4 The growth regression curve equation of D.salina under different concentrations of phosphorus

表5 不同P浓度下杜氏盐藻的生长率K回归曲线方程Tab.5 The growth rate regression curve equation of D.salina under different concentrations of phosphorus

图3 不同P浓度下杜氏盐藻的生长曲线Fig.3 The growth curves of D.salina under different concentrations of phosphorus

图4 不同P浓度下杜氏盐藻的生长率曲线的变化Fig.4 The growth variation rate of D.salina under different phosphorus concentrations

2.3 不同c(N)/c(P)对杜氏盐藻生长的影响

当培养液中其他营养因子一致时，杜氏盐藻的生长主要受N、P的影响。当c(N)/c(P)为40时，杜氏盐藻的终细胞浓度和平均生长率K具有最大值，表明c(N)/c(P)=40最适合杜氏盐藻的生长(图5)。通过单因素方差分析表明杜氏盐藻的生长受高N低P或低N高P的影响，其中以低氮浓度高磷浓度最为显著(P＜0.05)。

3 讨论

本试验以f/2营养液为基本配方，设定不同的N、P浓度水平，通过N、P营养盐限制下与杜氏盐藻的生长关系的研究表明：杜氏盐藻对N、P依赖性较强，不同N质量浓度梯度对杜氏盐藻生长具有显著性影响(P＜0.05)，但对杜氏盐藻生长率 K的影响不显著(P＞0.05)。添加 N 和P都可以明显促进杜氏盐藻的生长，营养盐浓度越高，生长速度越高，在实验初期生物量增加较快，但随着培养时间的增加，生物量的增加幅度比实验初期减小。随着P浓度的提高杜氏盐藻增长速度差异比较明显，添加不同的P浓度对杜氏盐藻的生长影响比不同N浓度的影响明显，这说明杜氏盐藻的生长更易受P浓度变化的影响，这可能是由于绿藻对P的要求比N高的原因所致[9]。

N、P是藻类生长最重要的控制因素，存在着交互作用，若c(N)/c(P)大于16，P起主要作用；当c(N)/c(P)小于10时，N起主要作用；当c(N)/c(P)为10～20时，限制因子不确定[10]。结果表明，杜氏盐藻在低N、P条件下的生长状况好，最适宜c(N)/c(P)是40，要清楚了解杜氏盐藻与营养盐之间的关系，还需要做进一步的深入研究。

图5 不同c(N)/c(P)对杜氏盐藻平均生长率的影响Fig.5 The effects of different c(N)/c(P)on the growth of the average growth rate of D.salina

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