人肝脏组织CYP3A4酶活性的高效液相色谱法测定

张海朋，赵 杰#，张莉蓉，王晓飞，薛文华

1)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052 2)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是药物在体内代谢的重要酶系，其中CYP3A最为丰富,约占CYP450总量的30%～40%。CYP3A包含CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43四种亚型[1]，其中CYP3A4参与了60%现有药物的体内代谢，是人体药物代谢的最重要的肝药酶之一，CYP3A4的代谢数据和药动学参数更是新药临床前评价所必需的资料[2]。但是由于个体间CYP3A4酶活性可存在5～60倍的差异[3-4]，所以在进行CYP3A4酶活性的测定时，须选择特异性比较好的探针药物。咪达唑仑(midazolam,MDZ)主要经CYP3A4体内代谢为1’-OH MDZ，1’-OH MDZ与MDZ的单点血药浓度之比可反映CYP3A4的酶活性，与众多的CYP3A4酶底物有着良好的相关性，是研究体内CYP3A4酶活性较理想的探针药[5-6]。作者在文献基础上对CYP3A4酶活性的体外孵育HPLC测定方法进行了改进，对50例肝脏标本CYP3A4酶活性进行了测定，并对不同性别、年龄、肝胆病变情况与酶活性的强弱进行了关联性分析，为进一步研究CYP3A4酶活性的个体差异性提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1标本来源标本取自郑州大学第一附属医院肝胆外科的住院患者50例，其中男28例，女22例；年龄3～87(43.2±17.5)岁;肝癌21例，肝血管瘤16例，胆组织病变13例。患者进行肝胆切除手术时取边缘正常的肝脏组织，用准备好的冻存管装载包裹，迅速投入液氮(-196 ℃)中冷却保存。患者均签署了知情同意书，该研究方案得到郑州大学医学伦理委员会认可。

1.2仪器和试剂Agilent 1200高效液相色谱仪和台式高速低温离心机D-37520型(德国Heraeus公司)；MDZ标准品、1’-OH MDZ标准品( 北京汇智泰康医药技术有限公司); NADPH、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，Tris-HCl、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、MgCl2、 CaCl2、蔗糖等试剂均为市售分析纯，实验用水为超纯水。

1.3溶液的配制

1.3.1 匀浆缓冲液 精密称取13.92 g K2HPO4，2.72 g KH2PO4，0.037 2 g EDTA，1.016 5 g MgCl2·6H2O，加超纯水定容至1 L，用NaOH调pH至7.4，室温保存。

1.3.2 洗涤缓冲液 精密量取6.93 mL HCl,12.114 g Tris,1.017 g MgCl2·6H2O，加超纯水定容至1 L，用NaOH调pH至7.4,室温保存。

1.3.3 蔗糖缓冲液 精密称取1.392 g K2HPO4，0.272 g KH2PO4，8.558 g蔗糖，加超纯水定容至100 mL，制成0.25 mol/L蔗糖缓冲液,室温保存待用。

1.3.4 标准溶液 精密称取0.017 1 g MDZ标准品，加超纯水定容至5 mL，制成10 mol/L MDZ标准溶液，-4 ℃条件下保存待用。精密称取10 μg 1’-OH MDZ标准品，加超纯水配制的体积分数50%甲醇溶液定容至1 mL，制成1’-OH MDZ标准溶液，-4 ℃条件下保存待用。

1.4肝微粒体的制备和体外孵育取适量肝组织，用洗涤缓冲液反复冲洗至土黄色，用滤纸擦干后称质量；每g加入3 mL匀浆缓冲液，充分匀浆；4 ℃，12 500g离心20 min； 取上清液，加CaCl2溶液，混匀，冰浴5 min，轻轻搅拌数次，27 000g离心20 min；弃上清液，沉淀用洗涤缓冲液洗涤，27 000g离心20 min；弃上清液，沉淀用含蔗糖溶液悬浮均匀；分装，于-80 ℃保存备用。采用BCA蛋白测定法测定微粒体的蛋白含量。实验前将所用试剂、用具置于4 ℃预冷；以上操作均在4 ℃条件下进行。孵育体系总体积125 μL，包含EDTA、MgCl2、肝微粒体蛋白适量、MDZ标准品适量，加PBS 补足体系至125 μL，体系中各组分的终浓度分别为EDTA 0.1 mmol/L、MgCl25 mmol/L、肝微粒体蛋白1 g/L。孵育体系在37 ℃水浴中预孵育5 min后，加入2 g/L NADPH 12.5 μL启动反应，孵育20 min，冰浴终止反应。

1.5体外孵育HPLC方法的建立

1.5.1 样品制备 孵育体系冰浴冷却终止反应后，加入25 μL氢氧化钠溶液碱化，用1.25 mL乙醚萃取，涡旋混合1 min，3 000 r/min离心10 min，分离1 mL有机层，常温下氮吹干，取流动相溶解残留物，13 000 r/min离心后吸上清液40 μL进样。

1.5.2 色谱条件 色谱柱为Angel C-18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇乙腈水(体积比531334),流速为1 mL/min，检测波长220 nm，柱温25 ℃，进样量40 μL。

1.5.3 标准曲线的绘制 取6支EP管，各加入空白孵育体系，精密吸取1’-OH MDZ标准溶液加流动相稀释配成终质量浓度为200、500、1 000、2 000、4 000、6 000 μg/L的1’-OH MDZ溶液，按1.5.1方法处理，制备平行双管，用外标法定量，以1’-OH MDZ的色谱峰面积为纵坐标，对应的浓度为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。

1.5.4 回收率、精密度及稳定性 于空白孵育体系(不加NADPH)中加入1’-OH MDZ标准溶液，分别配成终浓度为300、1 500、5 000 μg/L的低、中、高浓度的孵育体系，按1.5.1项方法处理后上样。平行测定5次，计算回收率。1 d内和连续3 d内测定5次，计算日内和日间变异。分别在当天及室温下放置24 h后测定1’-OH MDZ浓度，考察色谱峰的相对保留时间和峰面积的一致性。

1.6标本中CYP3A4酶活性检测取6支EP 管，按1.4条件下配制孵育体系，加入适量的MDZ标准品，使每个反应体系中MDZ 终浓度分别为4、6、8、12、18、24 μmol/L，37 ℃条件下孵育20 min， 反应结束后按照1.5.1项下方法处理后进样，记录色谱图。根据标准曲线计算6个体系中1’-OH MDZ 生成量, 并计算体系内1’-OH MDZ的质量浓度[S]，求出每个反应体系的速率V, 根据Eadie-Hofstee方程式[7], 以V/[S]为横坐标,V为纵坐标拟合回归曲线。回归曲线的斜率即为Km值。

1.7统计学处理应用SPSS 17.0分析，不同性别患者Km值的比较采用两独立样本t检验，患者年龄与Km值的相关性采用Pearson相关分析，不同肝胆疾病患者Km值的比较采用单因素方差分析及SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1HPLC方法学结果

2.1.1 专属性 在该色谱条件下，1’-OH MDZ和MDZ的保留时间分别约为10.05和15.02 min，分离度好，且峰型对称，孵育体系的内源性杂质不干扰酶活性的测定。见图1。

2.1.2 标准曲线 标准曲线为Y= 0.002 8X+0.009 5，r= 0.995 2，1’-OH MDZ在200～6 000 μg/L范围内线性关系良好。

2.1.3 回收率 低、中、高3个浓度组的回收率结果测定见表 1，RSD<5%，符合测定要求。

图1 孵育体系中的1’-OH MDZ和MDZ的色谱图

表1 1’-OH MDZ 的回收率(n=5)

2.1.4 精密度 低、中、高3个浓度组的精密度测定结果见表 2，RSD<5%，符合测定要求。

表2 1’-OH MDZ 的精密度(n=5)

2.1.5 稳定性 低、中、高3个剂量组的稳定性测定结果见表 3，RSD<5%，符合测定要求。

表3 1’-OH MDZ 的稳定性(n=5)

2.2不同性别、年龄和肝胆病变患者Km的比较

50例患者Km值为1.75～30.17 μmol/L。男性Km值为(6.990±1.241) μmol/L，女性为(7.762±1.312) μmol/L，2者比较差异无统计学意义(t=0.422，P=0.671)。患者年龄与Km值无相关关系(r=0.188,P=0.051)。不同肝胆病变患者Km的差异亦无统计学意义(表4)。

表4 不同肝胆病变患者的Km值 μmol·L-1

F=1.046,P=0.259。

3 讨论

通过体外孵育测定MDZ在肝微粒体中的代谢产物,以代谢产物的生成速率为标准对CYP3A酶活性进行评价的方法已被国内外所认同[8]。研究[9]也已经证实1’-OH MDZ是CYP3A4 的特异性代谢产物，1’-OH MDZ测定含量能特异性地反映CYP3A4酶活性的强弱。 作者采用体外孵育的方法，以MDZ为底物对肝组织中CYP3A的酶活性进行了测定。研究结果显示，MDZ与1’-OH MDZ的出峰时间、分离度均较好，且峰形均匀没有杂峰，因此所构建的HPLC方法可以满足肝组织中CYP3A4酶活性的测定。

国外研究显示[3-4]：不同个体间CYP3A4 酶活性差异很大。Zhu 等[10]认为在中国汉族人中CYP3A4酶活性呈单态分布，个体间约有14倍的差异。该研究测得50例标本的Km值为1.75～30.17 μmol/L ，个体差异较大。结合临床资料的研究结果表明，不同性别、年龄和肝胆病变患者Km值差异无统计学意义。但研究[11]认为CYP3A4酶活性女性高于男性， Zhu等[10]的研究结果亦显示CYP3A在代谢MDZ活性上女性高于男性。该研究结果可能是因为样本量较少的缘故。

综上所述，作者成功建立了测定肝组织中CYP3A4酶活性的HPLC方法，该方法可快速准确测定肝组织中CYP3A4酶活性。

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