根皮苷对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的抑制作用*

杜幼芹 刘 英 汪鋆植 冯天艳 邓改改 龚 权

(1.三峡大学医学院人体寄生虫学教研室，湖北宜昌 443002；2.天然产物研究与利用湖北省重点实验室, 三峡大学，湖北宜昌 443002；3.长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

血吸虫性肝纤维化是血吸虫可溶性虫卵抗原引起的，以肝虫卵肉芽肿和肝纤维化为特点的免疫性疾病(Boros,1989)。研究表明，吡喹酮治疗后未成熟虫卵仍可继续发育，虫卵肉芽肿反应仍在继续，而且一旦肝纤维化达到一定程度，即使去除诱因，肝纤维化仍将继续(Robertsetal., 1993; Gryseelsetal.,2006)。因此，在虫卵肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期如何用药物干预、控制其发展，成为吡喹酮治疗后控制血吸虫性肝病发展的关键。然而，至今尚无高效低毒药物用于血吸虫性肝病的治疗。

根皮苷(Phloridzin)是根皮素 (Phloretin)的 2′-β-D-葡萄糖属于植物黄酮类中的二氢查尔酮苷，存在于苹果属多种植物中，在根、茎、叶和果实中均有分布。与其他黄酮类相比，二氢查尔酮苷在自然界存在很少，被称为“少数黄酮类”(Christianetal.,2010)。根皮苷具有多种生物活性，如降血糖(Masumotoetal.,2009)、 平衡雌激素(Wangetal.,2010)、抗氧化、保护心脏、并对急性肝损伤有保护作用(Amoletal.,2009；Vasantha Rupasingheetal.,2010；冯天艳等, 2010；)等,且还具有低毒(屈克义等,2010)的特点, 这使它在很多领域中得到应用。本课题以日本血吸虫Schistosomajaponicum感染小鼠作为肝纤维化模型,观察根皮苷对小鼠肝纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物及试剂：根皮苷:天然产物研究与利用湖北省重点实验室 (三峡大学)提供, 从湖北海棠中提取分离得到,纯度为 98%。由天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)提供。复方鳖甲软肝片，内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，批号：20090625。吡喹酮片，南京制药厂有限公司，批号：20090704。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、羟脯氨酸(HYP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，小鼠血清透明质酸(HA)ELISA试剂盒为上海研吉生物科技有限公司提供的美国R&D systems产品，其他试剂皆为分析纯。

1.1.2实验动物及钉螺: 6～8周龄清洁级昆明小鼠40只， 雌、雄各半，体重(20±2)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，动物生产许可证号为：SCXK(鄂)2009-0007；将动物置于室温25℃环境下，饲养笼饲养，自由饮水，以全价颗粒饲料喂养。感染中国大陆株日本血吸虫尾蚴的阳性钉螺购自江西省寄生虫病防治研究所。

1.2 方法

1.2.1感染及分组：按常规将钉螺放入去氯离子自来水中逸出尾蚴，小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40～50条/只，然后随机将未感染和感染日本血吸虫尾蚴昆明小鼠分成4组A～D，未感染空白对照组(A)、模型组(B)、复方鳖甲软肝片组(C)、根皮苷组(D)，每组10只。于感染后第42 d，B、C、D组均给予吡喹酮灌胃治疗，500 mg/(kg·d) 2日疗法，A组以生理盐水灌胃对照。吡喹酮灌胃治疗后，C组给予灌胃复方鳖甲软肝片1 000 mg/(kg·d)×60 d，D组灌胃根皮苷40 mg/(kg·d)×60 d，A和B组均以生理盐水灌胃作对照。

1.2.2血清样品收集与检测：末次给药后，禁食不禁水过夜，24 h后摘眼球取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST水平，ELISA法检测血清中HA含量，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.3肝组织样品处理：取小鼠肝脏，用4℃预冷生理盐水冲尽表面浮血，滤纸拭干、称重，按肝体指数=(肝脏重量(g)/体重(g))×100%公式计算小鼠肝体指数，然后取小鼠肝脏右叶同一部位切成4 mm薄片，4%中性甲醛固定，石蜡包埋，制作厚4μm 连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察肝组织中虫卵肉芽肿的大小；胶原纤维染色(Masson染色)，光镜观察胶原沉积情况，并应用图像分析系统计算胶原纤维面积。每只小鼠做1张切片，每张切片随机取5个视野，计算每个视野中蓝色胶原分布的面积，其和为该切片纤维化面积，用于判断肝纤维化程度；另取肝组织0.1 g测定其HYP含量，操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 血清HA、ALT、AST含量

与A组相比，B和C、D组血清中HA、ALT、AST含量均升高，其中B组最高。而C、D组与B组相比，均能显著降低血清中ALT、AST、HA含量(P<0.05或P<0.01)(表1)。

表1 根皮苷对肝纤维化小鼠血清HA、ALT、AST的影响Tab.1 Effects of phloridzin on the level of HA, ALT and AST in serum of hepatic fibrosis mice

注：与模型比,*P<0.05，**P<0.01。

Note:*P<0.05 compared with the model group B,**P<0.01 compared with the model group B.

2.2 肝组织中HYP含量

A组中HYP含量极低，模型组B和各治疗组C、D肝组织中HYP含量均明显升高，其中模型组最高。而C、D组与模型组B相比，根皮苷和鳖甲软肝片均能显著降低肝组织中HYP含量(P<0.05或P<0.01)，也能明显降低小鼠的肝体指数(P<0.05或P<0.01)(表2)。

表2 根皮苷对肝纤维化小鼠肝体指数、肝HYP、肝胶原面积的影响Tab.2 Effects of phloridzin on hepaticsomatic indices, HYP and collagen area of the liver of hepatic fibrosis mice

注：*表示与模型比P<0.05，**表示P<0.01.

Note:*P<0.05 compared with the model group B,**P<0.01 compared with the model group B.

2.3 肝脏组织病理变化

A组小鼠肝脏表面光滑，红褐色，HE染色镜下见肝细胞沿肝小叶呈放射状分布，Masson染色未见蓝色胶原沉积。B组小鼠肝脏明显增大，表面布满大小不一的灰白色颗粒，镜下见大量虫卵肉芽肿，汇管区及虫卵肉芽肿周围纤维增生明显，大部分虫卵肉芽肿出现坏死病灶及纤维化，肝血窦扩张充血，大量炎性细胞浸润，虫卵肉芽肿周围以及汇管区大量蓝色胶原沉积。C、D组小鼠肝脏轻微增大，质地中等，表面灰白色结节明显少于B组，镜下虫卵肉芽肿面积和数量明显减小，蓝色胶原面积明显低于B组，肝纤维化程度明显降低(表1、2; 图1)。

图1 根皮苷对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的影响Fig.1 Effects of phloridzin on hepatic fibrosis caused by Schistosoma japonicum infectionA～D: Masson染色(×100); E～H: HE染色(×100). A, E：空白组; B, F：模型组; C, G：复方鳖甲软肝片; D,H：根皮苷.A-D: Masson staining (×100); E-H: HE staining (×100). A, E: Blank group; B, F: Model group; C, G: Complex liver soften tablet of turtle; D, H: Phloridzin.

3 讨论

肝纤维化是纤维增生和分解不平衡导致肝纤维组织过度沉积的结果。反复或持续的肝损伤或炎性病变，可使细胞外基质(ECM) 合成过多而降解相对不足，从而形成肝纤维化。肝星状细胞(HSC)目前被公认是ECM的主要来源细胞，HSC的激活是肝纤维化形成的初始中心环节(Friedmanetal.,2004)。血清HA是反映肝细胞细胞外基质代谢的血清学指标，与肝纤维化程度有明显相关性。HA为糖胺多糖类物质，在肝内由HSC合成并释放入血液循环中，而肝细胞可清除和降低循环血液中HA。肝纤维化时，由于HSC的增殖和激活以及肝细胞的功能下降，致使HA不但合成增加，而且清除下降。所以，HA是反映肝纤维化的敏感指标，也可反应肝纤维化程度(Kopke-Aguiaretal.,2002；Massartetal.,2006)。

近来的研究显示很多中药材中的总黄酮对慢性肝炎、肝纤维化、急慢性肝损伤等有很好的保护作用(陈飞虎等,2007；吴繁荣等,2008；丘志春等,2010)。我们前期的研究显示，湖北海棠总黄酮对日本血吸虫性肝纤维化有很好的抑制作用(杜幼芹等,2011)，而根皮苷是总黄酮的主要成分，本实验采用的根皮苷是从湖北海棠叶总黄酮提取的，治疗小鼠血吸虫性肝纤维化的结果显示根皮苷能明显改善日本血吸虫感染引起的肝脏病理变化，减小肝脏虫卵肉芽肿面积，降低肝脏组织中HYP含量，减少胶原纤维在肝脏组织中沉积，且降低血清中ALT、AST、HA的水平，对小鼠血吸虫性肝纤维化有确切的治疗效果。说明总黄酮中对小鼠肝纤维化发挥抑制作用的就是根皮苷，根皮苷在改善肝纤维化中的作用与复方鳖甲软肝片相比效果相同，其作用机制可能与降低血清中HA酶的含量有关。

本研究提示，根皮苷可以作为吡喹酮治疗血吸虫病的辅助用药，用吡喹酮有效杀虫治疗的同时，如能尽早服用根皮苷，有可能改善血吸虫病患者肝纤维化的预后。