体外诱导骨髓间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠的实验研究*

陈志伟 张海燕 费洪新 李鑫 刘超 张维龙 马丽萍 孙红丹

随着社会现代化的发展，脱髓鞘疾病的发病率逐年增加。髓鞘脱去后的治疗是亟待解决的难题，目前，细胞移植治疗脱髓鞘性疾病是研究的热点。研究表明，骨髓间充质干细胞不但具有自我更新和增殖的能力，而且可经诱导向神经细胞方向分化[1]。因此，本实验建立大鼠脱髓鞘模型，体外诱导骨髓间充质干细胞进行分化移植治疗，观察不同剂量的少突胶质细胞移植对脱髓鞘性疾病的改善及对脊髓神经功能恢复的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择50只成年雄性大鼠，随机分五组，每组10只，分别为对照组、模型组、治疗组A（0.02 μl/g），组 B（0.04 μl/g），组 C（0.08 μl/g）。

1.2 仪器与试剂 SIGMA2-16型水平离心机（Sigma公司），CO2培养箱（Heraeus公司），多通道电生理检测仪（澳大利亚Powerlab），青霉素-链霉素、胎牛血清（美国Gibco）。

1.3 模型建立 大鼠脊髓匀浆与弗氏完全佐剂（CFA）混合作为抗原佐剂乳化物。大鼠麻醉后仰卧，开腹，开胸，剪断下腔静脉，用止血钳固定心脏，将左心室剪开，灌注管插进主动脉，以冰生理盐水心脏灌注，至右心房流出清亮液，取大鼠脊髓，挑去脊膜及血管，称重，加等量的CFA，用注射器反复抽打制成油包水状态，即抗原佐剂乳化物。治疗组大鼠尾根部皮肤消毒，进行皮下注射抗原佐剂乳化物0.2 ml，对照组动物注射等量CFA＋生理盐水。

1.4 少突胶质细胞诱导分化 大鼠处死取股骨、胫骨，置D’Hanks液中，暴露髓腔，用DMEM培养液冲洗至骨髓腔变白，将冲洗液收集于培养瓶中。加入bFGF、胰岛素样生长因子、EGF诱导[2]。在含DMEM培养液5 ml、体积分数为0.1的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素中，37℃、CO2下培养，每3天换1次培养液，待贴壁细胞90%融合，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，然后加等量培养液终止消化，转移至无菌离心管中离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，用培养液重悬细胞，按1：2传代。选第4代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，离心加入诱导液转移至含有盖玻片的培养皿中，细胞数为1×104个/cm2，放入CO2箱中培养48 h后，诱导祖细胞更换培养液，用分化培养液培养3 d。将在含10 μmol/L BrdU的少突胶质细胞培养基中生长72 h，终止培养，并用0.01 mol/L PBS清洗生长面数次。加入0.25%胰酶溶液消化细胞数分钟，加入少突胶质细胞培养基中止胰酶消化。用培养基吹打细胞制成悬液，调整细胞浓度至1.0×105cells/μl备用[3-4]。

1.5 移植治疗 治疗组A、B、C大鼠给予少突胶质细胞移植治疗，少突胶质细胞移植前1天至实验结束每日给予环孢素A（10 mg/kg）注射[5]。以大鼠脊髓损伤区域为中心，上下2 mm范围内在2～4个点处注射[6]。吸取少突胶质细胞悬液注射到治疗组 A（0.02 μl/g），组 B（0.04 μl/g），组 C（0.08 μl/g），模型组给予生理盐水。

1.6 大鼠后肢运动功能检测 本实验采用BBB运动功能评分对少突胶质细胞移植后大鼠后肢运动功能的恢复进行比较。后肢全瘫为0分，完全正常为21分[7]。评分时将受试动物置于平面场地上，连续观察4 min，根据BBB评分法评价大鼠后肢运动功能，评分时间为移植治疗后第1、4周进行。

1.7 大鼠脊髓神经电生理功能检测 脱髓鞘疾病通常造成脊髓运动、感觉神经传导通路受损，引起运动诱发电位（MEPs）和体感诱发电位（SSEPs）的改变，移植术后1、4周时检测大鼠MEPs和SSEPs变化情况。记录分析MEPs和SSEPs波形曲线，比较波峰潜时和波幅变化。

1.8 统计学处理 所有数据经SPSS 17.0统计学软件处理，计量资料以（±s）表示，采用两独立样本t检验，计数资料比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组BBB评分的变化见表1。

表1 各组BBB评分的变化（±s） 分

表1 各组BBB评分的变化（±s） 分

*与对照组比较，△与模型组比较，#与治疗组A比较，▲与治疗组B比较，P<0.05

组别 治疗后1周 治疗后4周模型组（n=10） 5.9±1.9* 6.7±4.2*对照组（n=10） 20.1±0.9 20.1±0.9治疗组A（n=10） 6.1±2.2*△ 8.2±3.7*△治疗组B（n=10） 8.4±2.8*△ 12.6±4.8*△#治疗组C（n=10） 12.1±2.8*△ 16.9±5.2*△#▲

2.2 各组电生理功能比较见表2。

3 讨论

髓鞘的正常功能对维持神经轴突的生理功能有着重要意义。对于该病的治疗方法有胚胎干细胞移植法和神经干细胞移植法，但是涉及到伦理道德、取材困难等问题，治疗效果不理想。现在细胞分化移植治疗脱髓鞘性疾病是研究的热点，治疗效果较好[8]。

本实验从大鼠骨髓组织中分离出间充质干细胞，诱导分化为少突胶质细胞。将分化出的少突胶质细胞制成悬液，用于移植治疗大鼠脱髓鞘疾病的恢复。结果显示，与模型组BBB评分（5.9分）比较，治疗组BBB评分提高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组电生理评分（SSEPsN1、MEPs N1波峰潜时，SSEPsN1、MEPs N1波幅）比较，各治疗组电生理有明显不同变化，差异有统计学意义（P<0.05），并呈现剂量依赖性，表明将动物的骨髓间充质干细胞植入损伤脊髓中能有效减轻神经功能的缺损程度。从骨髓中抽提分离骨髓间充质干细胞，经体外培养扩增后，并且诱导为少突胶质细胞移植到脊髓脱去部位，发现神经电位出现波动，神经电生理活性明显增强，说明强化神经组织的修复过程是可行的治疗手段，能有效缓解脱髓鞘的功能[9]。

表2 各组电生理评分变化比较（±s） 分

表2 各组电生理评分变化比较（±s） 分

*与对照组比较，△与模型组比较，#与治疗组A比较，▲与治疗组B比较，P<0.05

1周4周MEPs N1波幅对照组（n=10） 15.2±3.2 8.2±2.7 11.3±3.7 31.7±8.5 14.9±5.8 8.1±2.7 13.4±4.1 33.6±11.2模型组（n=10） 32.0±10.6* 23.6±7.8* 3.1±1.1* 11.2±3.7* 24.8±6.8* 21.3±5.4* 3.2±1.7*△ 19.8±6.7*△治疗组A（n=10） 27.5±10.5*△ 18.3±4.7*△ 5.2±1.2* 14.3±5.4*△ 21.4±7.3*△ 17.8±7.4*△ 6.4±1.5*△ 27.5±8.2*△治疗组 B（n=10） 24.4±8.3*△# 14.8±4.6*△# 7.8±1.3*△# 19.3±6.4*△ 16.7±6.9*△# 15.6±4.5*△# 9.7±3.6*△# 24.2±8.7*△#治疗组 C（n=10）17.9±7.2*△#▲ 9.5±3.6*△# 10.2±1.2*▲ 26.2±4.6*#▲ 14.2±4.6*△#▲ 12.3±3.4*△#▲ 12.2±3.8*△#▲ 20.8±6.9*△#▲组别SSEPsN1波峰潜时MEPs N1波峰潜时SSEPsN1波幅MEPs N1波幅SSEPsN1波峰潜时MEPs N1波峰潜时SSEPsN1波幅

综上所述，体外诱导骨髓间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠效果较好，这为脱髓鞘性疾病治疗提供了新的方法和途径，为临床研究提供科学依据。

[1]王少云.骨髓基质干细胞移植治疗脊髓损伤进展[J].昆明医学院学报，2007，13（2）：86-90.

[2]陈红霞，高英茂，邴鲁军.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2003，12（1）：12-15.

[3]闫西刚，贡志刚，兰青，等.大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及分化的相关实验研究[J].中国微侵袭神经外科杂志，2007，12（4）：175-179.

[4]许永涛，李锋，刘铁，等.骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（3）：498-501.

[5]Benetti F， Ventura M， Salmini B， et al. Cuprizone neurotox-Icity，copper deficiency and neurodegeneration[J]. Neurotoxi-cology，2010，31（3）：509-517.

[6]McDonald J W， Belegu V. Demyelination and remyelination after spinal cord injury[J]. J Neurotrauma，2006，23（3-4）：345-359.

[7]王民，王栋琪，宋焕瑾.脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复不同评分标准的比较[J].西安交通大学学报（医学版），2006，27（2）：243-245.

[8]Ankeny D P， Popovich P G. Central nervous system and non-central nervous system antigen vaccines exacerbate neuropathology caused by nerve injury[J]. Eur J Neurosci，2007，25（1）：2053-2064.

[9]吴波，郭树章，蒋涛，等.少突胶质前体细胞移植对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响[J].解放军医学杂志，2009，34（5）：534-536.