β防御素-2和γ干扰素在尖锐湿疣皮损中表达的研究

屈丽 甄莉

尖锐湿疣（CA）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见性传播疾病之一，主要通过性接触传染。由于CA的发病率呈上升趋势，且有资料表明，某些生殖器的乳头瘤病毒感染还与肿瘤的发生有关[1]，因此该病已引起人们的广泛重视。IFN-γ又称免疫干扰素，在拮抗细胞内病毒感染起重要作用[2]。人β-防御素2是人体中可诱导性的防御素，是机体抵御病原微生物入侵的重要组成部分，并与多种皮肤病的发生、发展相关[3]，而HBD-2与尖锐湿疣的相互关系，国外鲜有报道，国内还未曾有类似报道，笔者研究HBD-2、IFN-γ在尖锐湿疣皮损中的表达，以进一步探讨HBD-2和IFN-γ在尖锐湿疣的发病和转归中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本 收集近3年经临床与病理确诊为尖锐湿疣的病例，25例入选的尖锐湿疣患者均为本院皮肤性病门诊就诊的初发CA患者，25例尖锐湿疣患者中，男15例，女10例，年龄20～65岁，病程15 d～7个月。取20例寻常型银屑病患者皮损标本作为阳性对照，男12例，女8例，年龄18～75岁，病程1个月～2年。取本院整形外科美容整形手术患者作为正常对照组，共25例，男15例，女10例，年龄16～45岁。入选所有病例3个月内均未接受免疫疗法及其他治疗，且排除自身免疫性疾病和其他感染性疾病。

1.2 方法 蜡块行4 μm切片，常规脱蜡、水化，柠檬酸修复，磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗，3%过氧化氢灭活，PBS浸洗后，山羊血清室温孵育20 min，滴加一抗，HBD-2、IFN-γ的一抗来自武汉博士德公司，工作浓度分别为1：100、1：200，4 ℃过夜，PBS浸洗后，滴加二抗（武汉博士德公司），显色，封片。省略一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 显微镜下观察，HBD-2、IFN-γ以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。阴性结果为不着色。每张切片于光学显微镜下随机选取5个高倍镜视野（×400）。利用MIAS22000图像分析系统件测定阳性区域平均光密度值，以平均光密度值代表阳性产物表达的多少。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件对各组平均光密度值进行数据分析，组间比较采用Wilcoxon秩和检验，指标间相关性分析采用Spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBD-2的表达 正常皮肤的基底层可见HBD-2的少量表达，尖锐湿疣皮损的基底层可见表达。银屑病皮损的表皮全层可见表达。HBD-2在尖锐湿疣表皮中的表达，比正常皮肤高（Z=-5.147，P<0.05），但比银屑病皮损低（Z=-7.174，P<0.05）。见表1。

2.2 IFN-γ的表达 在正常皮肤的表皮层可见IFN-γ的表达，尖锐湿疣皮损基底层表达可见表达，在银屑病皮损的表皮全层可见表达。IFN-γ在尖锐湿疣表皮的表达比正常皮肤和银屑病（Z=-6.311，P<0.05；Z=-7.230，P<0.05）均低。见表1。

2.3 相关性分析 尖锐湿疣组中HBD-2和IFN-γ的相关系数r为0.123，P=0.467>0.01，无统计学意义，在尖锐湿疣中HBD-2和IFN-γ无相关性。

表1 HBD-2、IFN-γ在尖锐湿疣、银屑病和正常人皮肤的表达情况

3 讨论

自1984年中性粒细胞分离出HNP-3以来，已有数十种防御素被发现，其中β-防御素2是人体中第一个被发现的可诱导的防御素，也是目前研究最深入的防御素之一。1997年Harder[4]发现银屑病角质形成细胞中HBD-2表达增高，此后在包皮、肺、气管、口腔黏膜、皮肤的上皮及肿瘤组织中均发现其表达。国内外多项研究发现，防御素有广谱抗细菌、抗真菌、抗病毒活性和细胞毒性等作用并与多种疾病的发生、发展有关[5]。近年来，对艾滋病的研究发现，HIV-1诱导HBD-2mRNA的表达量为正常口腔上皮细胞产生HBD-2的4倍[6]。研究发现HBD-2在尖锐湿疣皮损中的表达较正常皮肤高，但较银屑病皮损中的HBD水平低，推测HBD-2在尖锐湿疣的转归上有着重要的作用。

对IFN-γ在尖锐湿疣皮损区的表达的研究中发现，IFN-γ的表达主要见于基底层，较正常对照组及银屑病组均偏低，这与郭雨良等[7]使用ELISA法检测了尖锐湿疣疣体中IL-2和IFN-γ的水平的实验结果是一致的，这种低表达可能是导致尖锐湿疣发病和病情反复的重要原因，一些研究表明CA的发生、消退、复发及癌变都与机体的免疫功能有关[8]。尖锐湿疣患者主要是因为Th1与Th2功能失衡，Th1型细胞因子，如IFN-γ的降低使细胞免疫功能下降[9]，不能有效的清除病毒，Cauda等[10]的研究亦证明了这个观点。

HBD是通过各种刺激因子包括细菌和各种炎症因子刺激产生的（例如TNF-α，IFN-γ和IL-1）[11]，但是这些基因转录激活的分子机制尚未定义[12]。Kanda等[13]通过测定银屑病血清中HBD-2及多个细胞因子的水平分析了HBD-2对人外周血中T细胞产生细胞因子的影响，发现患者血清HBD-2水平比对照组高，并且IFN-γ，IL-17，TNF-α，IL-1β等增加了角质形成细胞分泌HBD-2，HBD-2在T细胞可能结合了PTX敏感性G蛋白偶联受体（S），通过JNK，MEK/ERK和PI3K/Akt途径促进IFN-γ，TNF-α，IL-10等的产生，HBD-2和IFN-γ有着相互促进的作用。

Kreuter[14]的研究就表明，在角质形成细胞中HPV病毒可以诱导HBD-2的产生，人乳头状瘤病毒诱导HBD可能是由于病毒的E5蛋白激活了表皮生长因子受体所导致的，而具体的机制还有待进一步的研究。研究显示尖锐湿疣皮损中的HBD-2和IFN-γ不成正比，推测HBD-2可能是由病毒分子直接上调的，或者在尖锐湿疣中防御素与IFN-γ相互诱导的途径受到了阻碍。IFN-γ的降低可能是导致尖锐湿疣难治和易复发的一个重要原因，而HBD-2高于正常皮肤却低于银屑病的皮损处，可能是由于尖锐湿疣虽然产生了一定的防御素的表达，但不足以完全抵御HPV的感染，这与Meyer-Hoffert等[15]得出的尖锐湿疣患者相对寻常疣低水平表达HBD-2，且临床上皮疹持续时间较长的结果是相一致，这项研究为尖锐湿疣的治疗提供新的思路。

[1]方超平，李紫，张军，等.尖锐湿疣患者病损部位高危型人乳头瘤病毒的检测及其临床意义[J].检验医学，2006，21（4）：392-395.

[2]曹彦明，甄莉.β-防御素-2、IFN-Y和NF-KBp65在寻常型银屑病皮损中表达的研究[J].医学研究，2011，40（5）：80-83.

[3]方向明.β-防御素2研究进展[J].浙江大学学报，2006，35（6）：581-584.

[4]Harder J，Bartels J，Christophers E，et al.A peptide antibiotic from human skin[J].Nature，1997，387（6636）：861.

[5]Ganz T.Defensins and host defense[J].Science，1999，286（5439）：420-421.

[6]Miguel EQM，Michael M L，Feng Zhimin，et al.Human epithelial[beta]-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication[J].AIDS，2003，17（16）：39-48.

[7]郭雨良.女性尖锐湿疣患者疣体组织皮损匀浆中IFN-γ及IL-2检测的临床意义[J].医学信息杂志，2011，25（4）：2320.

[8]kobayashi A，Miaslowski C，Wallhngen M，et a1.Recent development in understanding the immune response to human papillomavirus infection and cervical neoplasia[J].Oncol Nuts Forum，2000，27（4）：643-651.

[9]Arany I，Rady P，Tyring S K，et al.Effect of IFN therapy on HPV copy number inpatient swith condyloma acum inatum[J].Am J Med Sci，1995，310（1）：14-18.

[10]Cauda R，Tyring S K，Grossi C E，et al.Patients with condyloma acuminatum exhibit decreased interleukin-2 and interferon gamma production and depressed natural killer activiky[J].J Clin Immunol，1987，7（4）：304-311.

[11]张瑞芳，甄莉.TNF-ɑ、IFN-γ诱导人角质形成细胞防御素β的表达[J].中国麻风皮肤病杂志，2010，26（1）：8-10.

[12]Harder J，Bartels J，Christophers E，et al.Isolation and characterization of human-defensin-3，a novel human inducible peptide anti-biotic[J].J Biol Chem，2001，276（8）：5707-5713.

[13]Kanda N，Kamata M，Tada Y，et a1.Human{beta}-defensin-2 enhances IFN-{gamma} and IL-10 production and suppresses IL-17 production in T cells[J].Leukoc Biol，2011，89（6）：935-944.

[14]Kreuter A.Human papillomavirus-associated induction of human beta-defensins in anal intraepithelial neoplasia[J].Br J Dermatol，2009，160（6）：1197-1205.

[15]Meyer-Hoffert U，Schwarz T，Schroder J M，et a1.Expression of humanbela-defensin-2 and 3 in verrucae vulgares and condylomataacuminata[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2008，22（9）：1050-1054.