姜黄素对人宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的作用的研究以及p53表达的影响*

姜智慧 陆晓媛 周健

姜黄素（Curcumin）是一种酚类化合物，提取自姜科姜黄属植物姜黄（Curcumalonga）的根茎中，是中药姜黄的主要成份。国内外的科学研究表明，姜黄素具有具有抗炎、抗氧化、保肝、保护心脏、预防血栓和抗肿瘤的多种生物学效应[1-4]。姜黄素可以调节多种肿瘤相关的细胞因子及通路达到抗肿瘤的作用，对宫颈癌细胞具有一定的细胞毒作用[5]。但是有关姜黄素对宫颈癌细胞体外作用的相关机制仍有待研究。本文主要探讨姜黄素对人类宫颈癌Hela细胞的相关作用，检测p53蛋白的表达情况，为姜黄素防治宫颈癌提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人宫颈癌Hela细胞株（中国医学科学院血液病研究中所惠赠）。

1.2 主要试剂 姜黄素、二甲基亚砜（DMSO）、MTT购自美国Singma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖型购自美国Gibco公司；RT-PCR 反应试剂盒北京天根生化科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂盒（RTL-离心柱型）购自上海锐捷生物工程有限公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；p53抗体购自美国Bioworld Technology公司;鼠抗β-actin抗体北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 细胞培养 宫颈癌Hela细胞株采用加入100 mg/L 链霉素和100 U/L 青霉素各1 ml的DMEM培养液，置于 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞长至体积占细胞瓶体积比约 95%时，按1：2～3比例传代。取细胞生长良好，活性大于98%的细胞进行后续试验。

1.4 姜黄素对Hela细胞增殖影响的检测 用MTT法检测姜黄素对Hela细胞增殖影响。用含有10%胎牛血清的DMEM培养液将的Hela细胞配成 1×105/ml的悬液，在96孔板中加入 100μl细胞悬液，设5个平行孔。实验组加入不同浓度的姜黄素使其最终浓度为5、10、20、30、40、50μmol/L，同时设置对照组，分别培养12、24、48 h。培养结束后加入MTT（5 mg/L）20μl继续培养4 h，小心吸出孔内上清液100 μl，每空加入DMSO150 μl，震荡使结晶充分溶解，酶标仪测定读取Hela细胞的A490值，并按下述公式计算细胞增殖抑制率，重复实验3次以上。抑制率（%）=（1-给药组 A490值/对照组A490值）×100%。

1.5 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞细胞中p53基因 mRNA 转录水平表达的影响的检测 用RT-PCR法检测细胞中p53基因 mRNA 转录表达水平。收集姜黄素最终浓度为0、10、20、30、40 μmol/L的24 h Hela细胞为样本。用离心柱法提取总的RNA，根据紫外分光光度计260nm处的吸光度值测定RNA的纯度，并进行RNA的定量配成相同浓度的RNA，取1 μg总RNA进行逆转录，以cDNA为模板，进行PCR。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成见表1。p53基因扩增的反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min；循环36次；72℃再延伸10 min。β-actin 反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；63℃退火30 s；72℃延伸1 min；循环36次；72℃再延伸10 min。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像系统保存图像，重复实验3次后，Quantity One 系统进行灰度分析。见表1。

表1 各基因PCR 反应的引物序列

1.6 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞中p53蛋白含量表达的影响的检测 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞细胞中p53蛋白水平表达的影响的检测用Western blotting法检测细胞中p53蛋白表达水平。收集姜黄素最终浓度为0、10、20、30、40 μmol/L的24 h三个时段Hela细胞为样本。用RIPA细胞裂解液裂解细胞，蛋白提取试剂盒提取蛋BCA法进行蛋白定量，将所有蛋白样品调至等浓度。取25 μl蛋白样品，聚丙烯酰胺凝胶电泳，经 SDS-PAGE分离后，电转移至 PVDF膜上， 常规步骤封闭、洗膜后加入1∶1 000 稀释的兔抗人p53抗体；1∶1000 稀释的鼠抗β-actin 抗体，4℃冰箱放置孵育过夜；TBST洗涤，加入1∶500 稀释的HRP 标记的山羊抗兔/小鼠 IgG，室温孵育2 h；ECL 底物化学发光显色后曝光显影，通过 Bio-rad 化学发光成像系统进行曝光分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组数据间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验，各变量之间的关系采用直线相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 不同浓度姜黄素对人类宫颈癌Hela细胞的抑制率

2.1 姜黄素对人类宫颈癌Hela细胞增殖的影响 MTT检测结果显示，于对照组相比，浓度为5 μmol/L的姜黄素对Hela细胞增殖的抑制作用不明显；浓度大于10 μmol/L时抑制作用明显；当浓度达到40 μmol/L时抑制作用最为显著；但当浓度达到50 μmol/L时抑制作用增加不明显。试验表明经不同浓度姜黄素处理不同时间后，Hela细胞的增殖均受到明显抑制，抑制率见表2，差异有统计学意义（P<0. 05）。表明姜黄素对人宫颈癌Hela细胞的增殖具有抑制作用，且呈剂量-时间依赖性。见图1。

表2 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞的抑制率（±s）

表2 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞的抑制率（±s）

*与对照组相比， P<0.05

组别 12 h 24 h 48 h对照组 0.030±0.001 0.029±0.040 0.110 0.022* 0.129±0.010* 0.290 0.001* 0.254±0.029* 0.396?±0.149 5 μmol/L 0.093± ±0.010*10 μmol/L 0.125± ±0.144*20 μmol/L 0.230±0.002* 0.394±0.006* 0.416±0.008*30 μmol/L 0.442±0.021* 0.455±0.013* 0.481±0.007*40 μmol/L 0.559±0.016* 0.580±0.018* 0.647±0.007*50 μmol/L 0.573±0.004* 0.583±0.011* 0.681±0.027*

2.2 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞细胞中p53基因 mRNA 转录水平表达的影响的检测 取0、10、20、30、40 μmol/L姜黄素作用人宫颈癌Hela细胞24 h后，RT-PCR得到的p53 mRNA电泳条带见图2，条带经Quantity One 软件后发现，姜黄素作用后的Hela细胞中p53基因mRNA转录和表达水平随着药物浓度的增加和作用时间的延长而显著增加，灰度值见表3。与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。

表3 不同浓度姜黄素作用24 h时p53 mRNA/β-actin相对灰度比值的情况（±s）

表3 不同浓度姜黄素作用24 h时p53 mRNA/β-actin相对灰度比值的情况（±s）

*与对照组相比， P<0.05

姜黄素浓度（μmol/L） p53mRNA/β-actin相对灰度比值0 0.427±0.005 10 0.479±0.004*20 0.537±0.007*30 0.605±0.006*40 0.655±0.007*

图2 不同浓度姜黄素作用24 h后p53 mRNA的表达

2.3 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞中p53蛋白含量表达的影响的检测 取0、10、20、30、40 μmol/L姜黄素作用人宫颈癌Hela细胞作用24 h后，用Western blotting测得p53蛋白的表达随着姜黄素浓度的增加而增多，差异具有统计学意义（P<0.05），见图3。

图3 不同浓度姜黄素作用24 h后p53蛋白的表达情况

3 讨论

姜黄是是天然存在的多酚类化合物，一种常用中药，其主要成分姜黄素被用于食品行业作为食品添加剂，又因其为黄色的粉末，被染料业广泛应用。姜黄素曾经被传统的印度医生用来治疗厌食症，鼻炎、咳嗽，鼻窦炎、肝损害[6-7]。近年来，姜黄素由于抗肿瘤的活性引起了国内外学者的广泛的关注。单独应用姜黄素时发现，姜黄素有着抗肿瘤活性，同时具有抑制肿瘤转移和侵袭的作用[8-9]。姜黄素对体外培养的白血病细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞和卵巢癌细胞均有抑制增殖及诱导凋亡作用[10]，对表皮生长因子的促增殖作用有一定的拮抗效果[11]。还能抑制实验动物模型中多种肿瘤的发生[12]，并且能缩肿瘤大小，显著减少肿瘤数目，降低肺转移及淋巴转移。试验表明姜黄素能够抑调节肿瘤发病的相关基因，对肿瘤生长的的3个阶段即：启动期，加速期，对数期都有一定的抑制作用[13]。因此，姜黄素是目前化学预防和治疗肿瘤研究的热点之一，有望成为一种具有广泛应用前景的抗癌新药。

随着化疗药物的使用，其毒副作用也不可忽视，如脱发、电解质紊乱、口腔黏膜溃疡和白细胞数降、恶心、腹泻等。同时肿瘤细胞对化疗药物的耐药性也逐渐加强，姜黄素是唯一未见任何毒副作用报道的抗肿瘤药物。姜黄素可以减少化疗药物对正常细胞的伤害，从而降低药物的毒副作用，且有一定的化疗增敏作用[14]。在联合应用姜黄素和奥沙利铂的体外试验中时发现，姜黄素在明显提高奥沙利铂抗肿瘤作用的同时，还可以降低肿瘤细胞对奥沙利铂的耐药性[15]。在肝癌细胞的体外实验中，姜黄素分别于顺铂及阿霉素联合应用，结果显示姜黄素与顺铂联合的效果较好，并且可以下调c-IAP、Bcl-xl、c-myc、NAIP 和 XIAP等细胞因子，诱导细胞凋亡[16]。姜黄素同时体内外的宫颈癌细胞具有一定的抑制及诱导凋亡的作用[17-18]。本文以人宫颈癌Hela细胞为标本，加入不同浓度姜黄素后发现，姜黄素对Hela细胞有着一定的抑制作用，且呈时间-浓度依赖性，不同组别之间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。加入姜黄素后的宫颈癌Hela细胞，从正常的长梭状，逐渐缩小、变成圆形，同时核固缩，核碎裂逐渐增多。

野生型p53基因（wtp53）是重要的抑癌基因之一，位于17号染色体短臂，编码53kD核磷酸蛋白，p53蛋白通过调节相关蛋白参与细胞周期调控，阻止细胞从G期进入S期扩增，对细胞分裂及增殖起负调节作用。但是在体内外致癌因素作用下，p53可发生突变，导致wtp53丧失功能成为变异性p53。突变的p53具有致癌的特性，它失去对细胞的抗凋亡能力，对细胞的过度增殖达不到阻滞作用，这就导致细胞在致癌因素的刺激诱导下可以无限制的增殖，发展成为肿瘤。对于p53的相关研究认识后，学者们开发研究出一中抗癌新药：重组人p53腺病毒注射液。临床研究表明，单独或者联合应用重组人p53腺病毒对胃癌[19]、肝癌[70]、宫颈癌[21]、恶性腹水[22]等，有着较为明显的治疗效果。本论文主要研究不同浓度姜黄素作用下人宫颈癌Hela细胞中p53基因表达的情况的表达情况。取姜黄素浓度为0、10、20、30、40μmol/L作用24 h的Hela细胞为样本，测样本中p53mRNA的含量，结果可见随着浓度的增加p53mRNA的含量逐渐增加；Western blotting结果显示，随着姜黄素浓度的增加p53蛋白含量明显增加。可见姜黄素可能通过诱导抑癌基因p53的表达，导致p53蛋白含量的增加，促进癌细胞的凋亡，从而达到抑制宫颈癌Hela细胞的作用。

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