术前应用复方苦参注射液对结肠癌细胞的影响及机制研究

石晓明 吴胜春 杨永宾 唐 雷 吕柏楠

(河北省人民医院普外二科，河北 石家庄 050051)

结肠癌是临床常见的恶性消化道肿瘤，近年来其发病率、死亡率在国内外均呈上升趋势[1]。现代医学治疗结肠癌多是手术为主、辅以化疗的综合治疗，但治疗效果一直不能令人满意。近年来，为改善结肠癌的治疗效果，许多中药制剂的机制已得到充分研究，部分药物已用于临床并取得了较好的治疗效果[1-3]。复方苦参注射液即是这些中药制剂中疗效比较明确的一种，且该药物毒副作用较小[4-5]，但迄今关于苦参对结肠癌细胞作用的效果及机制研究尚不完全明确。2009-02—2011-10，我们对22例结肠癌患者术前给予复方苦参注射液，通过对手术及术后情况观察，术后肿瘤细胞生物学特征的检测，初步探讨了复方苦参注射液对结肠癌肿瘤细胞的作用机制，并与术前未应用复方苦参注射液的结肠癌患者20例对照观察，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部42例均为我院普外科住院患者，随机分为2组。治疗组22例，男13例，女9例；年龄39～72岁，平均(59.46±11.28)岁。对照组20例，男11例，女9例；年龄58～74岁，平均(62.19±9.96)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断及纳入标准 入组所有患者均有明确的结肠镜检查、CT检查及病理学活检诊断。纳入标准：所有患者本次手术前均未接受过放化疗等其他治疗，患者均不存在绝对手术禁忌证，部分患者患有与手术及麻醉相关的慢性疾病(如高血压、心脏病、糖尿病、肾病等)。

1.3 治疗方法 2组均于完善术前检查并制订手术计划后择期手术。治疗组于手术前予复方苦参注射液(山西振东制药股份有限公司，国药准字Z14021231)15 mL，加入0.9%氯化钠注射液250 mL中，每日1次静脉滴注，连续给药5 d。对照组手术前不予复方苦参注射液治疗。

1.4 观察指标及方法 手术后肿瘤组织取出后迅速投入液氮中速冻，然后转入-80 ℃低温冰箱保存。RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；荧光定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒(RT-PCR)购自美国Promega公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4.1 流式细胞术检测肿瘤组织细胞周期及凋亡率 细胞用0.25%胰蛋白酶[含0.02%四乙酸乙二胺(EDTA)]溶液消化，4 ℃，500 g离心收集细胞，沉淀中加入预冷的70%乙醇1 mL，轻轻吹打，4 ℃固定过夜。4 ℃，500 g，离心10 min，去上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。然后加入1 mL碘化丙啶(PI)染液将细胞重悬，4 ℃避光染色30 min后，FASCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测。以上实验重复3次。

1.4.2 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测肿瘤细胞水通道蛋白1(AQP1)mRNA、增殖细胞核抗原(PCNA) mRNA、生存素(Survivin) mRNA的表达 组织匀浆后，采用一步法常规方法提取组织总RNA。用美国Thermo公司 Nandrop 2000/2000C分光光度计测定RNA的纯度和浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。依照RT-PCR试剂盒说明书的要求，取RNA 1 μg，将其反转录为cDNA并建立PCR反应体系。建立20 μL PCR反应体系：1 μL反转录产物作为荧光实时定量PCR反应的模板、2×UltraSYBR Mixture 10 μL、10 μmol/L的上下游引物1 μL、无DNase-RNase水8 μL。利用荧光定量PCR仪(美国ABI公司Life Techologie 牌7500型定量PCR仪)扩增，PCR反应参数为：95 ℃ 5 min预变性后，95 ℃ 变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行40个循环，于每个循环的延伸阶段采集荧光信号检测目标基因与内参照基因的荧光强度(以GAPDH为内参照基因)。扩增完毕后，进入结果分析界面，计算目的基因表达的相对定量值(RQ值)且以此为依据进行统计学分析。实验所用引物序列如下：AQP1上游引物：5'-GTCCAGGACAACGTGAAGGT-3'，下游引物：5'-GAGGAGGTGATGCCTGAGAG-3'；PCNA上游引物：5'-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3'，下游引物：5'-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3'；Survivin上游引物：5'-CTTTCTCAAGGACCACCGCA-3'，下游引物：5'-GCCTCGGCCATCCGCT-3'。

2 结 果

2.1 2组手术及术后情况比较 见表1。

表1 2组手术及术后情况比较

由表1可见，2组手术及术后情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 2组肿瘤组织细胞周期及凋亡率比较 见表2。

表2 2组肿瘤组织细胞周期及凋亡率比较

表2 2组肿瘤组织细胞周期及凋亡率比较

组 别nG0/G1期S期G2/M期凋亡率治疗组2263.9±10.2*22.5±7.513.6±4.4*5.86±2.64*对照组2055.7±9.826.8±5.417.5±4.63.85±1.98

与对照组比较，*P<0.05

由表2可见，与对照组比较，治疗组G0/G1期肿瘤组织细胞增加(P<0.05)，S期、G2/M期肿瘤组织细胞减少(P<0.05)，凋亡率增高(P<0.05)。

2.3 2组肿瘤组织AQP1 mRNA、PCNA mRNA及Survivin mRNA水平比较 见表3。

表3 2组肿瘤组织AQP1 mRNA、PCNA mRNA及Survivin mRNA水平比较

与对照组比较，*P<0.05

由表3可见，治疗组AQP1 mRNA、PCNA mRNA及Survivin mRNA水平均明显低于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

中医学认为，结肠癌由忧思郁怒，饮食不节，久痢久泻，脾失健运，气机不畅，毒邪侵入，湿热蕴结，下注大肠，滞留积聚，凝结成积所致[6]。复方苦参注射液的主要成分为苦参、茯苓，其中苦参主治湿热泻痢、肠风便血、湿毒疮疡，对肿瘤有明显的抑制作用；茯苓清热利湿，解毒消肿，主治痈肿疮毒等疾患。复方苦参注射液在多种恶性肿瘤的治疗中已取得了较好的效果，且无明显的毒副作用[4-5]。本研究结果显示，使用复方苦参注射液后无不良反应，安全性较好。

本研究进一步应用分子生物学技术对复方苦参注射液治疗结肠癌的机制进行了初步探讨。研究结果发现，复方苦参注射液对结肠癌细胞的增殖凋亡具有明显的调节作用。流式细胞术结果显示，应用复方苦参注射液后更多的肿瘤细胞停留在G0/G1期，且凋亡率升高，说明本药具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制增殖的作用。对肿瘤细胞AQP1、PCNA、Survivind的表达进行了检测，结果显示肿瘤细胞AQP1、PCNA、Survivind表达均明显降低，提示复方苦参注射液可通过调控这3种基因表达而促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，这可能是复方苦参注射液治疗结肠癌的重要机制之一。

复方苦参注射液具有抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡的作用，但还有待进一步扩大研究规模以确定其效果，且本药具体机制尚待临床与基础实验结合进行进一步深入研究。

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