绵羊红细胞及补体活性对静注人免疫球蛋白(PH4)抗补体活性测定的影响

崔素梅，郝清华，高红琴(山西康宝生物制品股份有限公司，长治 046000)

静注人免疫球蛋白(PH4)是具有多种生物学活性的血液制品，临床上用于治疗原发性免疫球蛋白缺乏或低下症、原发性血小板减少性紫癜、重症感染、新生儿败血症、川崎病等［1］，因此具有广泛的应用价值。临床上常用静脉滴注，静注人免疫球蛋白(PH4)可在短时间内大剂量使用，并迅速进入血液循环，因而发挥作用快，但是一般的IVIG大剂量静脉注射会引起严重的副反应［2］，这是由于IVIG制品中存在抗补体活性，当抗补体活性(ACA)大于50%时能激活补体系统，释放过敏毒素 C3a，C5a.因此ACA是IVIG中一项极为重要的指标。据文献［3，4］报道，影响ACA的因素很多，这些因素多是生产过程中引起的，本文所讨论的是外在因素，是可以避免的，为此我们对山西康宝生物制品股份有限公司的3批次IVIG，分别用3个不同地方的绵羊红细胞、补体对照活性不同的补体进行抗补体活性测定，考察这两个重要因素对ACA测定结果的影响，为IVIG抗补体活性测定结果的判定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

双光束紫外可见分光光度计(TU－1901双光束紫外可见分光光度计);高级恒温水浴箱(501型，上海市实验仪器总厂);离心机(LDZS－Z型 ，北京医用离心机厂)。

1.2 试剂

钙镁离子贮备液:称取氯化钙1.103 g、氯化镁(MgCl2·6H2O)5.083 g，加纯化水使溶解成 25 ml，4℃保存备用。巴比妥缓冲贮备液:称取氯化钠41.5 g，巴比妥钠 5.096 g，加 900 ml纯化水使溶解，用1 mol/L盐酸调pH至7.3，加2.5 ml镁－钙储备液，再用纯化水稀释至1 000 ml，4℃保存备用。

明胶巴比妥缓冲液(当日配制)(SGVB):称取明胶0.625 g，加水适量煮沸使溶解，加100 ml巴比妥缓冲贮备液，加纯化水稀释至500 ml，临用前新鲜配制。

阿氏液:称取葡萄糖2.05 g，枸橼酸三钠0.8 g，枸橼酸 0.05 g，氯化钠 0.42 g，加蒸馏水溶解至100 ml，pH6.2 装于 250 ml瓶内，经 10 磅蒸汽消毒10 min(放气要快)，备用。

绵羊红血球:由绵羊颈静脉无菌采集全血与等体积的阿氏液混合，无菌分装于试管中，4℃保存1周后方可使用。如未污染细菌4周内均可使用。本试验采用北京、西安、长治3个不同地方的绵羊红血球，分别编号为 A、B、C。

溶血素:兔抗羊红血球血清，批号20112222。豚鼠血清(补体)，批号 20120119，20120212，20120526，20120721。

待检样品:静注人免疫球蛋白(PH4)(山西康宝生物制品股份有限公司)，批号:20120206，20120413，20120726，规格(5%50 ml)。

2 方法与结果

参照文献［5］的方法进行试验。

2.1 制备5%羊红细胞悬液

取绵羊红细胞，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次，2 000 r/min离心5 min，直至上层清液不显红色，弃去上清液后，20倍悬浮于明胶巴比妥缓冲液中，取0.2 ml血球悬液，加入 2.8 ml纯化水中，摇匀，在541 nm波长处测定OD值。根据下述公式，将该溶液OD值调到0.62±0.01，用此法调节的红细胞浓度为1×109/ml。

上式中，Vi为稀释前血球悬液体积，OD为稀释前血球悬液的OD值，Vf为稀释后血球悬液体积。

照上述方法分别将3个地方的绵羊红细胞分别制成5%的羊红细胞悬液。

2.2 溶血素的滴定

稀释溶血素:取0.1 ml溶血素加9.9 ml SGVB为1∶100 稀释。

先取7支试管，从第2管开始分别加入1 ml SCVB，往第1管、2管中各加1 ml 1∶100倍稀释的溶血素，从第2管中取1 ml混合液加入下一管，以此类推一直到第7管，使之分别为100，200，400，800，1 600，3 200，6 400 倍稀释;另外再取 2 支试管即8号管、9号管分别作为空白管和全溶管，按表1分别加入各项试剂。

37℃放置20 min，冰浴15 min之后，在对应的管内分别加入下列试剂。

表1 溶血素的滴定各成分加入量Tab 1 Input volume of each component for hemolysin titration

混匀，37 ℃ 60 min，冰浴3－5 min，2 000 r/min离心5 min，取上清液于541 nm波长处测定吸收值(OD)值，并计算溶血率。

从表3可知，采用不同地方的绵羊红血球，在溶血素稀释倍数相同和补体相同的条件下，溶血率数据明显不同。

表2 溶血素的滴定各成分加入量 (ml)Tab 2 Input volume of each component for hemolysin titration (ml)

根据表3数据，以Y值做纵坐标，Y=每管OD值/全溶管OD值。以不同溶血素稀释度为横坐标，得到饱和曲线。溶血素适宜稀释倍数为曲线的最高点的稀释度的一半，从而求出敏化羊血球所用的稀释度。试验要求最大溶血应在50%－70%范围，否则试验不成立。

由图1可知，A种绵羊红血球最高点稀释度为200，最大溶血率为60.6%，此批绵羊红血球，符合试验要求。溶血素敏化羊血球所用的稀释度为100。

表3 3个不同地方的绵羊红血球溶血素滴定数据Tab 3 Titration data of the sheep red blood cells from three geographical origins

图1 A、B、C三种绵羊红血球不同溶血素稀释度时溶血率Fig 1 Hemolysin dilution of the sheep red blood cells from three geographical origins at different titers

B种绵羊红血球最高点稀释度为400，最大溶血率为65.8%，此批绵羊红血球，符合试验要求。溶血素敏化羊血球所用的稀释度为200。

C种绵羊红血球最高点稀释度为800，最大溶血率为61.4%，此批绵羊红血球，符合试验要求。溶血素敏化羊血球所用的稀释度为400。

2.3 3个地方的绵羊红细胞最适敏化的羊红细胞(EA)的制备

将2.1项下制备的5%的3种绵羊红血球分别量取8 ml，一边轻摇红血球，一边滴入等量的稀释溶血素，37℃放置15 min后，2－8℃保存，6 h内使用。注意红血球不要往溶血素中倒，以免产生溶血。

2.4 滴定补体活性

用明胶巴比妥缓冲液适当稀释补体，一般取500，600，700的稀释倍数，然后按表4滴定补体。

加毕，混匀，37 ℃孵育60 min，0.5 h 摇一次，1 h再摇一次，冰水浴3－5 min，2 000 r/min离心5 min，取上清液于541 nm波长处测量OD值(见表5－7)。

表4 滴定补体活性各成分加入量 (ml)Tab 4 Input volume of each component for complement activity (ml)

表5 A种绵羊红血球滴定补体活性数据Tab 5 The complement activity of the sheep red blood cells of A

表5数据进行双对数回归分析后，可求出直线回归方程的截距(A)、斜率(B)和相关系数(r)，补体活性按下式计算，B在0.15－0.40之间表明试验成立，最好的分布范围是0.18－0.30之间。

补体活性=1/X×补体稀释倍数/5，式中:1/X为A值反对数的倒数。

500 稀释倍数:A=－0.226，B=0.188，r=0.998，1/X=1.683，GPC 效价 =1.683 × 500/5=168.3 CH50/ml。

600 稀释倍数:A=－0.142，B=0.207，r=0.999，1/X=1.387，GPC 效价 =1.387 × 600/5=166.4 CH50/ml。

700 稀释倍数:A=－0.074，B=0.208，r=1.000，1/X=1.186，GPC 效价 =1.186 × 700/5=166.0 CH50/ml。

以上三个稀释度的平均效价为:(168.3+166.4+166.0)/3=166.9 CH50/ml。

表6 B种绵羊红血球滴定补体活性数据Tab 6 The complement activity of the sheep red blood cells of B

表6数据双对数回归:500稀释倍数GPC效价=1.928×500/5=192.8 CH50/ml;600 稀释倍数 GPC效价 =1.611 ×600/5=193.3 CH50/ml;700 稀释倍数GPC 效价=1.396 ×700/5=195.4 CH50/ml。以上3个稀释度的平均效价为193.8 CH50/ml。

表7数据双对数回归:500稀释倍数GPC效价=1.816×500/5=181.6 CH50/ml;600 稀释倍数 GPC效价 =1.503 ×600/5=180.4 CH50/ml;700 稀释倍数GPC 效价 =1.294 ×700/5=181.2 CH50/ml。以上三个稀释度的平均效价为181.1 CH50/ml。

从以上A、B、C三种绵羊红血球滴定补体活性数据可知:不同的绵羊红血球滴定相同的补体，得出的补体活性的结果不同。

表7 C种绵羊红血球滴定补体活性数据Tab 7 The complement activity of the sheep red blood cells of C

2.5 抗补体活性测定

根据2.4项下测得的豚鼠血清补体活性，用明胶巴比妥缓冲液稀释至100 CH50/ml，按表8制备培育混合物。

表8 待检样品(20120206)及补体对照加入量的比例Tab 8 Input ratio of samples and complement controls

将表8混合物37℃保温60 min，之后从中取出0.2 ml加入到9.8 ml明胶巴比妥缓冲液中，按滴定补体活性方法测定剩余补体活性。

分别用A、B、C三种绵羊红血球，20120526批补体，测定20120206批IVIG的ACA，按照下列公式计算:待检样品ACA(%)=(a－b)/a×100%，式中，a表示补体对照管剩余补体活性(单位:CH50/ml)，b表示待检样品管剩余补体活性(单位:CH50/ml)。待检样品 ACA(%)分别为 25.2%，34.8%和0。

2.6 样品抗补体活性测定

溶血素、绵羊红血球、缓冲液等其他试材料相同，只是补体活性不同，根据2.4项下的方法滴定补体活性

待检样品抗补体活性根据2.5项下的方法测定，结果见表9。

根据表9的测定结果可知，补体活性不同，同一批样品测得的ACA结果差别巨大。

3 讨论

从实验结果可以看出，采集不同地方的绵羊所得到的绵羊红血球，在实验过程中，其他条件相同的情况下，溶血率数据明显不同，因而导致稀释度不同。按这样的结果滴定补体，从而引起补体活性的不同，用以上的结果分别测定同一批样品的ACA值，得到具有较大差别的结果。

在溶血素、绵羊红血球、缓冲液等其他试验材料相同的前提下，根据2.5项的方法测定3批样品中的ACA值，结果表明，补体的活性小于150 CH50/ml，样品ACA易出现假阳性。

表9 不同补体活性测定待检样品的抗补体活性的结果Tab 9 Results of anticomplementary activity of samples

基于在一些特定疾病的预防和治疗上的特殊性，IVIG制品被起来越广泛地用于临床，特别是近10年来临床需求量增加非常快［6］。所以IVIG制品的安全性、有效性十分重要。ACA是制品质量的一项主要指标。为了准确、可靠、及时地检测出数据，为生产提供质量保证，我们应消除实验中的影响因素，在IVIG抗补体活性测定中影响因素很多，需要我们继续探讨，但绵羊红血球和补体的活性是关键因素。

［1］ 侯麦花，孙凌云，卢新政.静脉注射用免疫球蛋白的应用及其机制［J］.中华风湿病学杂志，2004，8(7):433－435.

［2］ 任跃明，程雅琴，倪道明.静脉注射人免疫球蛋白的质量控制［J］.中国生物制品学杂志，2005，18(1):73－75.

［3］ 刘鹏翰，潘越飞，黎新.静脉注射用免疫球蛋白抗补体活性测定的影响因素探讨［J］.药物生物技术，1995，2(4):58－59.

［4］ 王宗刚，卢元志，张慧兰.静注人免疫球蛋白抗补体活性测定影响因素的探讨［J］.中国医药生物技术，2010，5(3):224－225.

［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录66－67.

［6］ 周海云，江丽君.静注人免疫球蛋白的研究与应用［J］.微生物学免疫学进展，2009，37(4):70－73.