Nrf2基因敲除对肝脏氧化应激及胰岛素抵抗的影响

倪 阵，闻勤生，赵曙光，张 哲，王旭霞，王景杰，刘震雄(第四军医大学唐都医院消化内科，西安 710038;通讯作者，E-mail:liuzx816@yahoo.com.cn)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是全球范围内最常见的慢性肝脏疾病之一，被认为是代谢综合征在肝脏的表现［1］。胰岛素抵抗(IR)和NASH关系密切，并能通过促进肝脏脂肪变性、细胞损伤和炎症反应，最终导致非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发展［2］，而氧化应激是诱导IR的重要危险因素，其可以直接或间接活化多种应激通路，进一步增加胰岛素受体底物－1(IRS-1)不连续的丝氨酸或苏氨酸磷酸化，从而抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，最终导致IR的发生［3］。核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是体内调节氧化应激的关键靶点，其可以通过促进多种Ⅱ相抗氧化酶和解毒酶的表达［4］，发挥重要的抗氧化作用，但Nrf2在肝脏IR中的作用尚未见明确报道。本实验将Nrf2基因敲除小鼠作为研究对象，通过给予4周高脂饮食，观察肝脏氧化应激及IR相关指标的变化，直接探讨Nrf2在肝脏IR发生中的作用。

1 试剂和方法

1.1 试剂

牛胆盐、胆固醇均购自西安昕泰生物技术责任有限公司;血糖、丙二醛(MDA)与谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物有限公司;兔抗鼠JNK多克隆抗体、兔抗鼠p-JNK多克隆抗体、兔抗鼠IRS-1多克隆抗体、兔抗鼠p-IRS-1多克隆抗体、β-actin均购自英国Abcam公司;羊抗兔IgG抗体、β-actin二抗均购自北京博奥森生物有限公司。

1.2 动物来源及分组

清洁级ICR雄性野生型(WT)和Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)小鼠各10只，6－8周龄，体重18－22 g，购自南京军区总医院比较医学科。所有小鼠适应性喂养1周后，按照随机数字法分为WT对照组(control)、Nrf2-/-对照组(KO)、WT 高脂饮食组(HFD)和Nrf2-/-高脂饮食组(KOHFD)，各5只。对照组给予普通饲料，由第四军医大学实验动物中心提供，高脂饮食组给予高脂饲料(在普通饲料基础上添加10%猪油、2%胆固醇和0.5%胆盐)，由西安迪乐普生物有限公司生产加工，每周记录小鼠体重变化。4周末，空腹12 h，行腹腔注射葡萄糖耐量实验，之后4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，肝脏称重，部分固定于4%多聚甲醛，行组织学检测，其余冻存于液氮中，留待检测。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 空腹血糖检测 下腔静脉采血，室温静置2 h，2 000 r/min离心10 min，吸取上清，按照血糖检测试剂盒说明书检测空腹血糖变化。

1.3.2 葡萄糖耐量实验(iPGTT)所有小鼠空腹12 h后，称体重，腹腔注射20%葡萄糖溶液(2 g/kg)，分别在 0 min，15 min，30 min，60 min 和 120 min，尾静脉采血，检测血糖变化并进一步计算时间－血糖曲线下面积(AUC)，公式为:

1.3.3 肝脏MDA和GSH检测 精确称取肝脏组织0.5 g，加入 4.5 ml预冷 PBS，手动匀浆 8 min，2 500 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒说明书检测MDA和GSH水平。

1.3.4 Western-Blot检测肝脏 JNK、p-JNK、IRS-1、p-IRS-1水平 取肝组织，研磨，裂解，提取蛋白并定量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，按照湿转法将电泳产物转移至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜，滴加一抗(1∶400)，室温 4 h，PBST 洗膜 3 次，10 min/次，然后滴加二抗(1∶2 000)，室温下孵育1 h，PBST洗膜3次，10 min/次。滴加 NBT/BCIP显色液，避光显色10 min，双蒸水洗膜终止显色，GelDoc凝胶成像仪采集图像。

1.3.5 肝脏组织学检测 取肝右叶部分组织，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片，行苏木精－伊红染色，光镜下观察肝脏组织学改变。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 生理指标变化

HFD组和KOHFD组小鼠体重增加均高于control组和KO组，但差异均无统计学意义(P＞0.05);与control组和KO组相比，KOHFD组小鼠肝脏质量显著升高(P＜0.05)，而HFD组小鼠肝脏质量与control组之间差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

2.2 肝脏光镜下改变

HE染色显示，control组和KO组小鼠肝脏肝小叶结构正常，肝细胞排列成条索状，围绕在中央静脉周围，呈放射状分布;HFD组小鼠肝脏组织结构较对照组明显紊乱，肝细胞内可见少量脂肪沉积，无明显炎症细胞浸润;而KOHFD组小鼠肝脏，脂肪沉积明显加重，部分细胞出现空泡变性，并可见少量炎症细胞浸润，主要位于静脉周围(见图1)。

图1 各组小鼠肝脏组织学改变 (×40)Fig 1 Changes of pathology of liver in four groups (×40)

2.3 肝脏氧化应激水平变化

HFD组和KOHFD组小鼠肝脏丙二醛水平均显著高于control组和KO组(P＜0.05)，且KOHFD组明显高于HFD组(P＜0.05);相反，与control组和KO组相比，HFD和KOHFD组小鼠肝脏谷胱甘肽水平均显著降低(P＜0.05)，且 KOHFD组明显低于HFD 组(P＜0.05，见表1)。

表1各组小鼠体重、肝脏重量、空腹血糖、肝脏GSH和MDA变化(x¯±s)Tab 1The changes of weight gain，liver weight，blood glucose，hepatic GSH and MDA in mice(x¯±s)

2.4 空腹血糖变化

KOHFD组和HFD组小鼠空腹血糖均高于control组和KO组，但差异均无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

2.5 葡萄糖耐量实验变化

腹腔注射葡萄糖后，HFD和KOHFD组小鼠血糖水平在15 min，30 min和60 min均高于control组和KO组，且KOHFD组小鼠15 min血糖水平显著升高(P＜0.05)，而HFD组和control组之间差异无统计学意义(P＞0.05);KOHFD组小鼠时间－血糖曲线下面积(AUC)显著高于control组(P＜0.05)，而HFD组与control组之间差异无统计学意义(P＞0.05，见图2)。

2.6 肝脏JNK/p-JNK、IRS-1/p-IRS-1表达变化

各组小鼠肝脏JNK和IRS-1蛋白表达水平均无明显差异;p-JNK表达水平在KOHFD组小鼠肝脏明显升高，灰度值显著高于 KO组(P＜0.05)，而在HFD组小鼠肝脏表达轻度升高，灰度值与control组相比无显著差异(P＞0.05);KOHFD组小鼠肝脏p-IRS-1表达显著减少，灰度值明显低于KO组(P＜0.05)，而HFD组小鼠肝脏p-IRS-1表达轻度下降，灰度值与control组之间无明显差异(P＞0.05，见表2、图 3)。

图2 各组小鼠葡萄糖耐量实验(iPGTT)和时间－血糖曲线下面积(AUC)Fig 2 The iPGTT and AUC results in four groups

表2肝脏JNK/p-JNK、IRS-1/p-IRS-1表达灰度值变化(±s)Tab 2The changes of grey value density of liver JNK/p-JNK，IRS-1/p-IRS-1 expression in mice(±s)

表2肝脏JNK/p-JNK、IRS-1/p-IRS-1表达灰度值变化(±s)Tab 2The changes of grey value density of liver JNK/p-JNK，IRS-1/p-IRS-1 expression in mice(±s)

与 control组比较，﹡ P ＜0.05;与 KO 组比较，△P ＜0.05

组别JNK p-JNK IRS-1 p-IRS-1 control组 1.573 ±0.132 1.436 ±0.096 1.689 ±0.087 1.613 ±0.167 KO 组 1.493 ±0.142 1.412 ±0.098 1.703 ±0.127 1.598 ±0.150 HFD 组 1.524 ±0.145 1.699 ±0.128 1.673 ±0.148 1.382 ±0.089 KOHFD 组 1.508 ±0.161 2.076 ±0.162﹡△ 1.681 ±0.189 1.003 ±0.079﹡△

3 讨论

图3 Western blot检测肝脏 JNK/p-JNK、IRS-1/p-IRS-1表达变化Fig 3 Expression of JNK/p-JNK，IRS-1/p-IRS-1 in livers by Western blot

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种在病理学上与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史的代谢性疾病，其疾病谱包括单纯性脂肪肝和脂肪性肝炎(NASH)。流行病学调查显示，其在全世界成人范围内的发病率约为17%－30%［5，6］。目前观点认为，单纯性脂肪肝属于良性病变，而NASH则可以进展至肝硬化、终末期肝病和肝癌。

本实验肝脏组织学检测显示，control与KO小鼠肝脏小叶结构清晰，肝细胞排列成条索状。给予4周高脂饮食后，HFD小鼠表现为轻度的肝脏脂肪变性，无明显炎症细胞浸润，而KOHFD小鼠肝脏脂质沉积较HFD小鼠明显加重，并显示出少量的炎症细胞浸润。这些结果说明，单纯敲除Nrf2对小鼠肝脏组织学无明显影响，而敲除Nrf2可以明显加重高脂饮食诱导下小鼠肝脏脂肪沉积和炎症变化。

氧化应激是促使单纯性脂肪肝向NASH进展的关键因素，当过量的活性氧(ROS)作用于生物膜上的多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)时，引发脂质过氧化反应，从而使细胞内生物膜的通透性和流动性发生改变，导致细胞结构改变和功能障碍［7］。但是，机体只有在抗氧化能力下降的状态下，氧化应激才能产生负面作用。丙二醛(MDA)是细胞毒性较强的脂质过氧化产物，它半衰期较长，并能够弥散到细胞内其他靶位，加重氧化应激损伤。核转录因子NFE2相关因子2(Nrf2)是体内调节氧化应激的中枢环节，正常情况下，其与Keap1结合，主要位于细胞质内，处于相对抑制状态，当受到外源性或内源性刺激后，Nrf2从Keap1中释放，转位进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)结合，从而调节靶基因的转录［8］，表达具有抗氧化作用的Ⅱ相解毒酶。谷胱甘肽(GSH)是一种重要的内源性抗氧化产物，可以对抗自由基对细胞和器官的伤害［9］。Nrf2可以通过调节谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸合成酶调节亚单位(GCLM)，调控GSH的合成［10］。我们前期的研究证实［11－13］，通过诱导 Nrf2核转位，可以明显降低肝细胞和高脂饮食诱导的氧化应激水平。本实验结果显示，与control小鼠相比，KO小鼠肝脏MDA及GSH水平均无明显变化，而4周高脂饮食后，HFD小鼠肝脏MDA水平显著升高，而GSH水平显著下降，说明HFD小鼠肝脏已经产生氧化应激，而KOHFD小鼠MDA明显高于HFD小鼠，GSH水平明显低于HFD小鼠。说明单纯敲除Nrf2对小鼠肝脏氧化应激水平无明显影响，4周高脂饮食可以导致小鼠肝脏氧化应激的发生，而敲除Nrf2后，小鼠肝脏氧化应激水平进一步加重。

NASH患者往往存在胰岛素抵抗，大量实验也发现，高脂饮食诱导的NASH动物模型，伴有不同程度的高血糖、高胰岛素血症和胰岛素敏感性下降［14］。肝脏是胰岛素作用的靶器官，当存在高胰岛素血症时，肝脏葡萄糖输出持续存在而加重高血糖，反之，高血糖则可以进一步刺激胰岛素分泌，从而加重胰岛素抵抗，形成恶性循环。胰岛素抵抗可以促进外周脂肪的水解，导致游离脂肪酸(FFA)向肝脏运输增加，同时，高胰岛素血症可以刺激肝脏的脂肪合成，从而导致脂质在肝脏大量沉积［15］。

最近有研究提示，高脂饮食诱导的NASH小鼠，肝脏是首要受损器官，肝脏胰岛素抵抗先于外周胰岛素抵抗的发生［16］，因此，肝脏IR是NASH进展的启动环节，而肝脏局部氧化应激的产生可能是诱发肝脏胰岛素抵抗的关键环节。其可以激活一系列信号通路，如JNK，而磷酸化的JNK则可以作用于胰岛素受体底物(IRS-1)，促进其丝氨酸磷酸化、抑制其酪氨酸磷酸化，从而抑制胰岛素信号的转导［17］。本实验结果显示，control组和KO组小鼠空腹血糖、iPGTT和AUC均无明显差异，4周高脂饮食后，虽然HFD小鼠空腹血糖、时间－血糖曲线下面积(AUC)均高于control组，但差异无统计学意义。Western blot检测发现，control组和KO组小鼠p-JNK与p-IRS-1无明显差异，HFD小鼠肝脏p-JNK与p-IRS-1水平和control组相比轻度升高，但灰度值差异无统计学意义，这些结果说明，HFD小鼠没有出现明显的肝脏和外周胰岛素抵抗。而在KOHFD小鼠，虽然空腹血糖与control与KO小鼠相比无统计学意义，但是葡萄糖耐量实验结果显示，15 min血糖水平和AUC显著高于control组，说明KOHFD小鼠虽没有发生高血糖，但是已经存在轻度外周胰岛素抵抗。进一步Western blot检测提示，JNK和IRS-1水平在各组间无明显差异，而KOHFD小鼠肝脏p-JNK显著升高，p-IRS-1水平显著降低，说明KOHFD小鼠已经出现了显著的肝脏胰岛素抵抗。这些结果证实，单纯敲除Nrf2对小鼠葡萄糖代谢及肝脏胰岛素信号通路无明显影响，而给予敲除Nrf2小鼠高脂饮食可以通过加重肝脏氧化应激水平，进一步作用于胰岛素信号通路，明显加速肝脏胰岛素抵抗的发生。

本实验采用Nrf2基因敲除小鼠作为研究对象，通过给予高脂饮食，发现敲除Nrf2可以促进肝脏脂质沉积和炎症细胞浸润，加重肝脏氧化应激水平，进而增加JNK磷酸化水平、降低IRS-1酪氨酸磷酸化水平而显著加速小鼠肝脏胰岛素抵抗的发生。本实验的研究结果为以Nrf2为靶点治疗NASH相关胰岛素抵抗提供了新的实验依据。

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