两种霍乱弧菌检测技术的应用研究

巩西玲

霍乱是由霍乱弧菌感染引发的一种流行广泛的甲类传染病。而霍乱弧菌是肠道传染病霍乱的病原体，被感染者可表现为剧烈呕吐、腹泻、脱水，甚至导致死亡［1］。该病的发病率及病死率很高，曾在世界范围内出现过多次大流行，对于霍乱的防治的关键在于对霍乱疫区的外环境标本进行及时监测。对霍乱弧菌做出快速、精准的检测是对霍乱预防、控制的主要方法。但其检测一直是困扰微生物检验工作的一个难题，尤其是外环境水质和食品中霍乱弧菌的检测，根据国内、外大量学者的研究，建立了许多有效的检测方法，并已作为目前临床的常用检测手段广泛应用。但霍乱弧菌在自然生存状态下的带菌量很少，常由于机制不清晰，同时，外环境标本掺杂大量其他菌群，从而导致霍乱弧菌的分离鉴定比较困难。常规培养法无法检出霍乱弧菌，为了有效提高外环境中霍乱弧菌的检出率，避免漏检的发生，我们采用荧光定量PCR检测方法，不仅提高了常规检测方法的灵敏度，而且可以有效避免聚合酶链反应(PCR)方法带来的假阳性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 样品来源 根据我市的霍乱病监测规定，将批发市场，农贸市场，餐厅暂养，销售的海、水产品共100份进行标本采集。

1.1.2 样品种类 所采集的标本100份共分5大类:包括鱼类 (20份):带鱼、黄瓜鱼、金钱鱼、鳝鱼、鲈鱼、鲫鱼、鲳鱼等;贝壳类 (20份):鲍鱼、牡蛎、蛏子、铁钉螺等;甲壳类 (20份):螃蟹、草虾、河虾等;蛙类 (20份):牛蛙、青蛙;水母类动物 (15份);甲鱼 (5份)。

1.1.3 试剂 碱性胨水和四号琼脂培养基购自北京陆桥生物试剂有限公司的半成品粉剂，霍乱诊断血清购自中国药品生物制品检定所，所有产品都在有效期内。

1.2 方法

1.2.1 常规分离鉴定法 霍乱弧菌属需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，对营养的需求也不高，通常采用浓缩碱性胨水作为选择性增菌培养基。具体方法:海产品20g加225ml碱性胨水;将pH值调至9.0，其增菌10h，取上层培养物接种到10ml碱性胨水中，做二次增菌培养，培养8h，两次均划四号琼脂平板进行分离培养，每个平板挑取略带灰色，8～18个高度怀疑的圆润透明如水滴样可疑菌落接种于营养琼脂平板。

1.2.2 PCR检测法 检测霍乱毒素基因ctxA和菌毛基因tcpA，取二代碱性胨水增菌液1.5ml，离心6min，弃上清液，加DNA裂解液，离心1min。取上清液做PCR模板，凝胶成仪观察结果。出现308bp条带为ctxA基因阳性。

1.3 统计学方法 计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

选取100份海、水产品同时用两种方法进行增菌培养，通过采用常规分离鉴定法，检测到霍乱弧菌呈阳性6份 (6%)，通过PCR检测法检测出霍乱弧菌呈阳性9份 (9%)。两组检测方法比较，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

表1 两种检测方法比较 (份)Table 1 Comparison of two detection methods

3 讨论

霍乱弧菌的主要致病因子是霍乱肠毒素，霍乱肠毒素的检出对霍乱弧菌的确定，是否能引起流行，具有较高的流行病学意义。截至目前为止，细菌培养、生化检查以及血清学鉴定均仍然作为霍乱弧菌实验室诊断的“黄金标准”［2］。海、水产品的样品采集方法直接影响着霍乱弧菌的阳性率，在过去的几年里，我们大多采用常规分离鉴定法对所采集的所有标本进行检测，检疫人员只要熟练掌握培养分离的条件和方法，就能从标本中筛离霍乱弧菌的病原菌。因此，该方法在过去的几年里，一直被列入《国家标准》和《霍乱防治手册》的推广应用中。但伴随着卫生检验技术的不断发展和进步，可以发现，该方法在进行增菌培养期间，由于分解代谢的产物不利霍乱弧菌的增殖，有的还会影响致病菌的生长，从而阻碍检出结果的准确性。霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中生长迅速，通常检疫人员会将标本置于37℃的培养基中，培养6～8h后，在取上层培养物做弧菌分离。该菌在营养琼脂和碱性琼脂上可见，表面无色，呈圆形，色泽透明，质感光滑，湿润，扁平或稍凸起，边缘整齐。为了方便检出，近年来，卫生部在《霍乱防治手册》中逐步推出海、水产品采用PCR检测法。本文就对五大类海水产品霍乱弧菌污染状况进行调查，通过对比发现，100份海、水产品同时用两种方法进行增菌培养，两种检测方法的灵敏度虽然一致，但对于含菌量少的标本，在检测上PCR检测法更具优势。由于在不同的选择性培养基上，霍乱弧菌会产生不同的菌落特征，因此，其培养基大多含有胆盐、十二烷基磺酸钠、亚硝酸钾、庆大霉素、多黏菌素等抑菌剂。通过采用常规分离鉴定法，检测到霍乱弧菌呈阳性6例，通过PCR检测法检测出霍乱弧菌呈阳性9例。即PCR检测法比常规分离鉴定法在霍乱弧菌含量较少的标本上，其检出率高，具有较好的敏感度和特异性。

PCR检测方法可分为多重PCR与常规PCR两种方法，所谓多重PCR检测法，主要是指一次反应可检测出多种基因，这样不但大大节约了所需时间及成本，还有效提高了检测效率。并能克服由于某种外因导致的检测结果出现假阳性。并且，多重PCR可快速鉴定其菌属是否为产毒株，还能从腹泻患者的粪便标本中检测到霍乱弧菌的肠道致病菌。从而有效提高感染性腹泻病原学诊断的水平，为多种致病菌的快速诊断提供了新的方法。传统的检测方法由于所用周期长、工作量大，并且，受环境、培养条件以及主观因素影响，不能满足疾病预防和控制的需求，不利于实验室的快速诊断。近年来，伴随着检测技术的不断进步，检测仪器的不断更新，探针的设计显得尤为精确，通过采用多通道荧光PCR仪的广泛使用，多重荧光定量PCR技术也显得尤为成熟，并且，具有高通量、低成本、高效率等多重优势，被研究学者广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为热点检测方法。建立了四重荧光定量PCR体系，从分子水平详细阐述了霍乱的发生、发展、分布等规律，为霍乱弧菌的研究提供了更多的思路，有效降低了单重荧光定量PCR检测毒力基因特异度不高造成结果假阳性的弊端，提高了检测效率，降低了检测成本，逐渐成为未来检测技术的新的发展趋势。并且，在进行标本采集时，需要注意样品从采集、运送、保存直至检测等环节均必须严格按照质量控制标准的要求。同时，按照参照《中国霍乱监测方案》的技术规定进行操作，每份样品均需要采集足够的数量，确保样品的代表性及有效性。值得注意的是，从1820年至今，我国的霍乱流行，都是由国外传人引起的，我国不是霍乱的疫源地圈。

有关部门必须加强海、水产品的监测，在进行海、水产品霍乱弧菌的检测中，由于霍乱弧菌菌型复杂，尤其是甲鱼，一旦受到霍乱弧菌污染，霍乱弧菌可能在其体内存活时间较长，并污染水体。同时，可能将霍乱弧菌传染给消费者，导致疾病。通过本文研究发现，鱼类、贝壳类、甲壳类、蛙类、水母类以及甲鱼均检出毒力基因为产毒株，具有流行性和致病性的可能。因此，做好霍乱预防工作，海、水产品的卫生状况对食品卫生和消费健康关系密切，加强饮食卫生监督管理，同时，加强全民健康教育，改善居民的不良饮食习惯，提醒人们尽量少生食海、水产品以防霍乱弧菌的传播流行，提高霍乱防治知识和意识，切断传播途径，防止霍乱疫情爆发。对保障我国国际旅行人员健康，保障正常国际交往和国际贸易均有非常积极的意义。综上所述，两种方法虽然各有优势，但PCR检测法用于霍乱弧菌的检测，能最大限度降低漏检的可能性，对临床检验及卫生检测有较高的指导意义。

1 吴以华，徐景野，李岳良，等.微量培养板不同保存时间对霍乱弧菌培养效果的观察［J］.中国卫生检验杂志，2007，27(4):629－630.

2 姚美琳，周发珍，王榕峰，等.2003—2007年厦门市海仓区外环境巾霍乱弧菌监测结果分析 ［J］.预防医学论坛，2008，14(10):924－925.