糖肝康对糖尿病脂肪肝模型大鼠肝脏结构的影响*

★ 钱秋海＊＊ 钱卫斌 郭春芳 蔡欣蕊 姜群群 冯晓 (.山东中医药大学附属医院内分泌科

济南250011;2.日本鸟取大学医学部 鸟取683－8503;3.山东省禹城市人民医院 禹城251200;4.山东中医药大学第一临床医学院 济南250014)

糖尿病脂肪肝是严重影响糖尿病患者身体健康的常见病，以糖尿病和肝脏结构异常并存为主要临床特征。近年来，随着糖尿病发病率的急剧增高，糖尿病脂肪肝的发病率显著增高。糖尿病脂肪肝一旦发生，既可出现肝脏脂肪沉积、肝功能异常，又会增加胰岛素抵抗，使糖尿病更难控制。本研究应用电镜和光镜观察糖肝康对肝脏组织病理及超微结构的影响。现报道如下。

1 实验材料

1.1 动物及饲料

健康雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由山东中医药大学试验动物中心提供，动物合格证号:SCXR(鲁)2005015;常规饲料由山东省实验动物中心提供;高糖高脂饲料(清洁级)由北京科澳协力饲料有限公司提供(配方:10.0%猪油，20.0%蔗糖，10.0% 蛋黄粉，0.5% 胆酸钠和 59.5% 常规饲料)。

1.2 药品及试剂

1.2.1 观察用药

糖肝康由生黄芪、白术、茵陈、黄芩、柴胡、炒栀子、丹参、大黄等药物组成(由山东中医药大学附属医院药房提供，实验时制成糖肝康浓缩煎剂，浓度为1.87g/mL 及 3.75g/mL。

1.2.2 对照用药 降糖甲片，由吉林敖东制药有限公司提供，生产批号:090314。给药时配成降糖甲混悬液，浓度约5.6g/mL。

1.2.3 动物模型用药 链脲佐菌素(Streptozocin，STZ):由美国Sigma公司生产，北京博爱港商贸有限公司提供。

1.3 实验仪器

电子天平(上海天平仪器厂);LXJ－Ⅱ型离心沉淀机(上海第二分析仪器厂);美国强生血糖分析仪(武汉绿森林科技发展有限公司);LG－10A高速冷冻离心机(日立公司);γ免疫计数仪(西安二六二厂);Reichert－Jung超薄切片机，由山东省医学科学院提供;日本电子(JEOL)JEM－1200EX透射电镜，由山东省医学科学院提供。

2 实验方法

2.1 造模方法

SD大鼠50只，给予普通饲料、自由饮水，适应性饲养3天后，改高糖高脂饲料喂养，6周后，禁食l2小时，断尾取血并用美国强生血糖仪测空腹血糖。按30mg/kg体重的剂量腹腔内注射新鲜配制的2%链脲佐菌素(柠檬酸缓冲液，pH4.2)。72小时后尾静脉取血测血糖，血糖高于16.7mmol/L者确定为糖尿病模型制作成功。选取40只大鼠进入实验。

2.2 分组及给药

将40只糖尿病大鼠随即分为4组(n=10):(1)模型对照组，(2)糖肝康小剂量组，(3)糖肝康大剂量组，(4)降糖甲对照组，每组10只。其中，模型对照组给予生理盐水10mL/kg灌胃;糖肝康小剂量组给予浓度为1.87g/mL的糖肝康灌胃;糖肝康大剂量组给予浓度为3.75g/mL的糖肝康灌胃;降糖甲对照组给予降糖甲混悬液56g/kg灌胃。实验各组均给药容积为10mL/kg，每日灌胃一次，高脂饲料饮食，正常饮水。另取10只正常大鼠作为正常对照组，每日10mL/kg生理盐水灌胃，并予正常饲料饮食，正常饮水。室温18－20℃，12小时交替照明。连续给药12周。

2.3 标本采集

上述大鼠给药12周后，给动物腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，迅速剖腹，并在冰盒上截取大鼠肝脏1mm3组织置于3%戊二醛中固定，4℃条件保存，备测大鼠肝脏超微结构。另取部分肝脏组织块以4%中性甲醛溶液，备测肝脏病理变化。

2.4 镜下观察

病理标本的制作:将肝脏组织4%中性甲醛溶液固定24小时，经各级酒精脱水，石蜡包埋，切片后HE染色，光镜下观察肝脏病理结构变化。

电镜标本的制作:将肝脏组织磷酸缓冲液冲洗，1%四氧化锇酸固定1小时，三蒸水冲洗，用50%、70%、90%、100%丙酮逐级脱水，室温下环氧树脂(EPON)812包埋浸透过夜。UITRACUTE超薄切片机切片(厚约60－70nm)，铀、铅双重染色，电子显微镜下进行肝脏超微结构观察。

3 实验结果

实验发现，正常组大鼠肝脏外观呈红褐色，质地软而富有弹性，边缘锐利。而模型组大鼠腹腔肥大，白色脂肪组织丰富，肝脏体积明显增大，颜色黄白，切面油腻感，呈典型的脂肪病变。

光镜下观察显示:正常组肝组织结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝细胞分界清，大小较一致，核1－2个，圆而清晰，核位于细胞中央，胞质丰富，肝窦排列规则，汇管区清晰，无炎症反应。而模型组大鼠肝细胞胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴，呈严重的脂肪变性;脂滴位于胞核周围或胞质一侧，将核挤向一边，有的融合成大脂滴，将细胞核挤压于细胞边缘;脂肪变性以周边带(汇管区)和中间带为最重，严重者可波及小叶中央带(中央静脉区)，肝小叶边界不清，肝索排列紊乱，少数动物肝窦和中央静脉有扩张现象，其间有红细胞堆积，其余肝窦闭塞.而糖肝康大剂量组可见肝细胞内脂肪变性明显减少，仅有少量脂肪空泡，无明显异型性，无核分裂性，肝小叶间纤维组织基本消失。降糖甲组的病变介于模型组和糖肝康大剂量组之间。如图1所示。

图1 糖肝康对糖尿病脂肪肝大鼠肝脏病理结构的影响(×200)

电镜下观察显示:正常对照组肝细胞的细胞核呈圆形或卵圆形，单核，胞浆中粗面内质网发达，滑面内质网较少。线粒体丰富，呈圆形或长圆形，内嵴显示清楚，偶见少数线粒体内嵴模糊。胞浆中极少见脂滴分布，其直径小于1μm;偶见胶原纤维增生。模型对照组:可见大量脂滴，大小不等，常3－5个成群，单个脂滴直径可达5μm;细胞核不规则，有凹陷，核内染色质异常，异染色质边聚，常染色质呈团块状;线粒体大小不一，分布不均匀，线粒体嵴模糊或空泛;部分内质网肿胀;可见胶原纤维增生。糖肝康大剂量组:超微结构基本恢复正常，细胞核形状基本规则，核周隙正常，偶可见核皱褶，染色质分布均匀，无溶解;胞浆内脂滴显著减少;线粒体肿胀、内质网扩张均不明显;可见少量胶原纤维增生。糖肝康小剂量组和降糖甲组肝细胞结构无明显差异，均介于模型对照组和糖肝康大剂量组之间。如图2所示。

图2 糖肝康对糖尿病脂肪肝大鼠超微结构的影响

4 讨论

糖尿病性肝病系指糖尿病引起的肝脏功能和组织学变化的病变，属于糖尿病慢性并发症范畴［1］。肝脏作为长期高血糖累及的靶器官之一，由于其代偿功能较强、早期的肝脏损害常常不明显等原因，糖尿病肝损害不容易引起人们的注意，胰岛素抵抗的患者直到发生糖尿病、高血压、高血脂以及血管疾病时才被发现肝损伤。而当肝损害进展至后期，如肝硬化，病情往往己经不可逆转。近年来，随着糖尿病发病率的急剧增高，糖尿病并发脂肪肝的发病率也有显著增高的趋势。据文献报道糖尿病肝损害的发生率为10% －30%［2］。糖尿病脂肪肝的存在使糖尿病的治疗难度加大，并直接影响糖尿病的疗效和预后。因此，对糖尿病脂肪肝的研究，正在逐步引起医学界的重视。

肝脏是胰岛素作用的靶器官，也是脂肪代谢的重要器官。肝脏对脂肪的摄取、氧化、脂肪酸代谢、胆固醇的生成、磷脂和脂蛋白的合成和分泌起着中枢性作用。正常状态下，脂类代谢在肝脏中保持着动态平衡。当脂代谢紊乱时，大量脂肪从脂库中动员分解出来，并且大部分进入肝细胞。肝内脂肪的增加超过了肝细胞将其氧化利用和合成脂蛋白运输出去的能力，则使肝细胞脂肪沉积及肝细胞变性，形成脂肪肝［3－4］。

我们根据中医理论，并结合多年临床经验认为，糖尿病肝损伤虽有糖尿病和肝损伤两种不同的表现，但因其发病于同一患者，且肝损伤是在糖尿病基础上发生的，二者必然具有一定的内在联系，治疗上应将其看作一个整体，才能收到显著的疗效。因而提出本病为多虚多瘀之证，其主要病机是以脾气亏虚为本，肝失调达、瘀毒互结为标。治疗上应以健脾益气治其本，调肝解毒活血治其标为治则。并精心组方，研制了糖肝康方，由生黄芪、白术、茵陈、黄芩、柴胡、炒栀子、大黄、白芍等药物组成，诸药合用共奏健脾益气、调肝解毒、清热化湿活血之功。

本研究结果表明:以健脾益气、调肝解毒活血为组方原则研制的糖肝康能有效的改善糖尿病脂肪肝大鼠肝脏组织的病理结构及超微结构，提示本方对糖尿病脂肪肝病变有显著的防治作用，值得进一步推广和研究。

［1］冼苏.糖尿病肝病的研究现状及进展［J］.广西医学，2004，26:918－920.

［2］沈稚舟，吴松华，邵福源.糖尽病慢性并发症［M］.上海:上海医科大学出版社，1999:321.

［3］Charltom M，Sreekumar R，Rasmussen D，et al.Apolipoprotein synthesis nonalcoholic steatohepatits［J］.Hepatology，2002，35:898 ～904.

［4］Horton JD，Goldstein JL，Brown MS.SREBPs:activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver［J］.J Clin Invest，2002，109:1 125 ～1 131.