益气活血方对大鼠缺血心肌血管新生及HGF影响的研究*

胡国恒 胡 哲 盛 望 陈励竞

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省湘潭市中心医院，湖南 湘潭 411100）

中药益气活血方对冠心病心绞痛具有良好的疗效。本研究用免疫组织化学法检测大鼠缺血心肌微血管计数（MVC）和微血管密度（MVD）及肝细胞生长因子（HGF）蛋白表达，进一步阐明益气活血方保护缺血心肌细胞、增进缺血心肌血管新生机制，为缺血性心脏病的中医药治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物 益气活血组方（湖南中医药大学附属一医院自制药）其药物成分：黄芪1000 g，当归200 g，川芎500 g，丹参500 g。麝香保心丸：批准文号为国药准字Z31 020068；生产厂商为上海和黄药业有限公司。

1.2 试剂与食品 大鼠HGF 试剂盒（上海继锦化学科技有限公司）；免疫组化染色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）；HGF 多克隆抗体（武汉博士德生物工程公司）；SABC 试剂盒（SA1022）（武汉博士德生物工程公司）；DAB 显色剂试剂盒（AR1022）（武汉博士德生物工程公司）等。DH-140 动物人工呼吸机（浙江医科大学医疗仪器实验厂产品）；四道生理记录仪（成都仪器厂产品）；CS-Ⅵ型摊片烤片机（湖北孝感市宏业医用仪器有限公司）；MIAS 医学图像分析系统（北航公司产品）等。

1.3 实验动物 健康雄性SD 大鼠32 只，体质量（230±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.4 造模方法 大鼠饲养1 周后造模，方法依据文献报道［1］的方法进行。以1%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，置于手术台，四肢皮下连接心电图电极，气管插管，连接空气呼吸机；于胸骨左旁第3～4 肋间切开皮肤，长约1 cm，逐层分离皮下组织、肌肉，暴露心脏及大血管根部，切开心包，轻挤大鼠胸廓，将心脏挤出，距左冠状动脉起点约2 mm 处用零号医用缝合线结扎血管，逐层关胸。恢复大鼠自主呼吸，拨出气管内插管，手术过程中分开胸后、缝针后、结扎后和关胸后4个点记录心电图变化。以心电图ST 段的改变及左室前壁向外膨胀发绀为结扎成功标志。术后腹腔注射青霉素8万U/只×3 d 以抗感染。

1.5 分组及给药 造模成功后雄性SD 大鼠32 只完全随机方法分成4 组：假手术组、心肌梗死模型组、麝香保心丸组和益气活血方组，每组各8 只。于术后24 h灌胃给药，每日1次，连续14 d。假手术组、模型组均予蒸馏水10 mL/kg 灌胃，麝香保心丸组灌服等剂量药物（12.13 mg/Kg），益气活血方组灌服药液（含益气活血方生药3.95 g/kg），末次给药后禁食24 h，不禁水，腹主动脉取血后处死大鼠，留心脏标本。饲养过程中模型组死亡2 只，麝香保心丸组1 只。

1.6 心梗边缘区MVC 及MVD 指标测量方法 用CD34单克隆抗体免疫组化染色后，血管内皮细胞被染成棕黄色。微血管判断标准：按参考文献方法［2-3］以CD34的表达来标记血管内皮细胞，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数。具体方法为：先在40×视野下找到心梗边缘区，选取微血管密度最高的区域，然后在400×视野下（图像分析系统所取的视野）计数大鼠心梗边缘区新生MVC，并用图像分析系统测定其MVD，每张切片随机选取5个视野，分别测定其MVC，MVD，取平均值作为本例大鼠的MVC，MVD 值。

1.7 免疫组织化学测定HGF 蛋白表达 光镜下观察，阳性染色细胞胞浆或胞膜出现黄色或棕黄色颗粒。采用IPP6.0 医学图像分析系统，每个组每个时间点分别选取5 张切片，每张切片随机选取5个视野，测定阳性着色累积光密度（IOD）值，对HGF 进行图像分析。

1.8 统计学处理 应用SPSS16.0 统计软件。实验数据以表示，采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌梗死面积比较 见表1。益气活血方组及麝香保心丸组心肌梗死面积较模型组明显缩小，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心肌梗死面积（IS）和缺血心肌HGF 蛋白表达比较（±s）

表1 各组大鼠心肌梗死面积（IS）和缺血心肌HGF 蛋白表达比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 大鼠缺血心肌微血管计数和微血管密度的比较见表2。益气活血方组及麝香保心丸组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠缺血心肌微血管计数（MVC）和微血管密度（MVD）比较（±s）

表2 各组大鼠缺血心肌微血管计数（MVC）和微血管密度（MVD）比较（±s）

2.3 大鼠缺血心肌HGF 蛋白表达的比较 见表1。在光显微镜下，各组大鼠心肌组织可见棕黄色蛋白表达。模型组与假手术组比较，HGF 蛋白表达明显升高（P＜0.05）；益气活血组方组及麝香保心丸组与假手术组比较，HGF 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；益气活血方组与模型组比较，HGF 蛋白表达明显升高（P＜0.05）；益气活血方组与麝香保心丸组比较，HGF 蛋白表达有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

冠心病的基本病机为气虚血瘀，病性属本虚标实。《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》云“阳微阴弦，即胸痹而痛”。阳微即本虚，阴弦即标实。王清任在《医林改错》中指出“元气既虚，必不能达血管，血管无气必停留而瘀”。气为血之帅，血为气之母，心气亏虚，运血无力，致心脉瘀阻，遂发为胸痹心痛。血瘀则脉络不通，不通则痛，是以气虚为本，血瘀为标，故证属本虚标实。唯有补气活血并用，方能气助血行，瘀去脉利。拟创益气活血方，益气活血，通络止痛。全方由黄芪、当归、丹参、川芎诸药组成。方中重用黄芪为君，温阳补气，气盛则血行，具有增强机体抵抗力、调节免疫、促进抗体合成保护心脑血管系统等诸多作用。在心血管系统方面，其通过清除自由基、保护细胞结构及抗凋亡保护心肌［4-5］。当归补血活血，具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、降低心肌耗氧量、改善微循环和抗凝血、抗血栓形成等诸多作用［6］。丹参活血祛瘀，通络止痛，其化学成分丹参酮、丹参素、丹参酚等具有抗动脉粥样硬化，抗血栓形成的作用，能促进心肌缺血或损伤的恢复，缩小心肌梗死范围［7-8］。川芎具有扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量，制血小板凝集，预防血栓形成，降低心肌的耗氧量，减轻心肌缺血再灌注损伤等作用［9］。三药共为佐药。诸药合用，使痹阻之心脉得以畅通，诸症自除。

肝细胞生长因子（HGF）具有促有丝分裂、促血管生成、抗凋亡、抗纤维化、抑制炎症反应、调节免疫等多种生物学功能［10-11］。其对血管内皮细胞和上皮细胞的促有丝分裂作用和抗凋亡作用在各种血管生长因子中是最强大的［12］。在兔、小鼠缺血模型中，HGF 能刺激新生血管生成，且不论在体内还是体外试验，HGF的血管生成活性被证实比血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）更为强大［13-14］。HGF 过度表达能刺激血管新生和侧支血管形成［15］。本研究用免疫组织化学法检测缺血心肌MVC 和MVD 及缺血心肌HGF 蛋白表达，实验结果表明，MVC、MVD 与HGF 蛋白表达呈正相关，说明益气活血方治疗缺血性心脏病其机制可能与其促进HGF 表达相关。

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