以DA-64 为显色剂吡喃糖氧化酶法测定血清1,5-脱水葡糖醇

潘利琴 张德亭 夏淑琦 连国军 赵长容

(1.温州市人民医院,浙江 温州 325000;2.温州医学院,浙江 温州 325000)

血清1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)的监测可确切地反映较短期内糖尿病的控制程度,其诊断糖尿病的价值已被临床充分重视[1]。测定1,5-AG的方法包括目前主要的测定方法GK-PROD 酶偶联两点法,均不能有效去除高浓度的葡萄糖干扰,易使1,5-AG 的测定结果偏高。因此,如何有效提高抗葡萄糖干扰能力是建立新的1,5-AG 测定方法的关键技术。根据参考文献,通过酶法途径将葡萄糖分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛,并使用一种新型的水溶性显色剂N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲基氨基)-联苯胺(DA-64)对反应过程中生成的过氧化氢(H2O2)进行定量,在此基础上建立了新的吡喃糖氧化酶法用于测定血清1,5-AG,现将此方法的应用及评价情况报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 (1)UV -2201 紫外可见分光光度计(日本岛津);(2)奥林巴斯5400 全自动生化分析仪;(3)CB171(A)半自动生化分析仪(上海合意检验设备有限公司);(4)pH-3C 酸度计(上海雷磁分析仪器厂)。

1.2 试剂 (1)1,5-AG 校准品：冻干品,临用前用1mL 去离子水复溶,2～8℃保存稳定15 天,由浙江夸克生物科技有限公司提供。(2)试剂I(R1)：含50mmol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液、30 KU/L ATP 依赖性葡萄糖激酶(ATP-GK)、50 KU/L 磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、20KU/L 6-磷酸果糖激酶(PFK)、20KU/L 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FDA)、10KU/L抗坏血酸氧化酶(ASO)、10KU/L 胆红素氧化酶、2.0 mmol/L ATP;(3)试剂II(R2)：含50 mmol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液、200 KU/L 吡喃糖氧化酶(PROD)、30KU/L 过氧化物酶(POD)、3.2mmol/L DA-64。所用酶购自日本旭化成公司,DA-64 购自日本Dojindo 公司,其他试剂为国产分析纯,水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 原理 (1)用ATP 依赖性葡萄糖激酶(ATPGK)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FDA)将主要干扰物葡萄糖分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛;其他干扰物抗坏血酸、黄疸分别在抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶作用下得以清除;(2)血清中1,5-脱水葡糖醇被吡喃糖氧化酶氧化产生H2O2并使DA-64 氧化显色,用全自动生化分析仪比色定量;(3)计算血清1,5-AG 浓度(C),C=(A2-A1)血清/(A2-A1)标准×C标计算,其中C 为血清1,5-AG 浓度(μmol/L),C标为标准溶液浓度(μmol/L)。

2.2 参数设定 反应类型为两点终点法;反应温度：37℃;主/副波长：700/800nm;样 品5μL,加试剂R1240 μL 反应3.5分钟后读取第1 点吸光度A1,加入试剂R280 μL 继续反应5分钟后读取第2 点吸光度A2。

2.3 结果

2.3.1 吸收光谱 以试剂空白为参比,测得标准管、测定管两者络合物最大吸收波长均在725nm处,由于日本Olympus AU5400 全自动生化仪无此波长,故选用靠近725nm 的700 nm 为自动分析法的测定主波长,并且选用800nm 为测定副波长,以减少脂浊、黄疸、溶血、血清本身颜色等对吸光度的影响。

2.3.2 抗干扰能力 在一份1,5-AG 浓度为375 μmol/L 的血清标本中,加入不同浓度的葡萄糖、抗坏血酸、胆红素、三酰甘油、血红蛋白等干扰物,以测定的相对误差在±5%内为不干扰。结果表明,在本法测定条件下,样品中各干扰物质的最大允许浓度为：葡萄糖85 mmol/L、血清胆红素350 μmol/L、三酰甘油(TG)8.0 mmol/L、血红蛋白5.0 g/L、抗坏血酸320 mmol/L,说明本法具有良好的选择性。

2.3.3 反应动力学曲线及读数点选择 取浓度分别为56、287、505 μmol/L 三份血清样本,在37℃条件下,将样本与R1 混合后观察反应曲线,结果表明从反应开始到5分钟所测得的吸光度没有明显变化;加入R2 后观察5分钟之内的反应曲线变化,结果表明三份血清样本在加入R2 4分钟后已经完全达到终点。结合奥林巴斯AU 5400 全自动生化分析仪的参数设置要求,实验选择R1 与样本反应3.5分钟后读取第1 点吸光度A1,加入R2 继续反应5分钟后读取第2 点吸光度A2。

2.3.4 校准曲线 取一份1,5-AG 浓度为550 μmol/L 的高值标本,采用样本量稀释模式(生理盐水)制备成0、68.8、137.5、275、550 μmol/L 5个浓度,每个浓度重复测定3次,结果表明本法线性范围可达550 μmol/L(图1),回归方程和相关系数分别为Y(测量值)=0.978X(理论值)+1.71,r=0.9999。

图1 本法的校准曲线

2.3.5 灵敏度 用本法连续测定空白样本(生理盐水)20次,计算和s,根据最低检测限(LLD)=+3s,得LLD 为1.05 μmol/L。

2.3.6 精密度 取三份不同1,5-AG 浓度的混合血清,按本法测定,批内精密度和批间精密度分别为1.03%～2.88%和1.87%～3.78%,详见表1。

表1 血清1,5-AG 检测精密度(n=20,±s)

表1 血清1,5-AG 检测精密度(n=20,±s)

注：*每个样品用本法平行检测20次;△同一样品用本法连续检测20 天

2.3.7 回收率试验 按本法测定,在已测得1,5-AG 为112 μmol/L 的血清标本中分别加入100、200、300μmol/L 的1,5-AG 纯组份进行回收试验,血清1,5 -AG 的回收率分别为103.4%、100.2%、97.6%,平均回收率为100.4%。

2.3.8 方法对比试验 用本法(Y)和参考方法(X)[2]分别测定50例血清标本,本法的测定结果为(128.9±88.3)μmol/L(n=50),参考方法的测定结果为(128.7±87.2)μmol/L(n=50),回归方程Y=1.011X-1.137,r=0.9987,经配对t 检验,两者差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3.9 试剂稳定性 将新配的1,5-AG 测定试剂分成A、B 两组,A组在4℃冰箱中开盖储存30 天,B组在4℃冰箱加盖储存12个月。两组试剂到达储存时间后,空白管及标准管吸光度值基本恒定,对含量为(75.0±7.5)μmol/L 的1,5-AG 质控品进行测定,A组试剂测定值为(74.2±4.7)μmol/L,B组试剂测定值为(73.3±5.2)μmol/L,与原值比较均无显著性差异(P＞0.05),说明本法1,5-AG 测定试剂具有良好的稳定性

2.3.10 参考值 选择200例体检合格的成年人,男100例,女100例,年龄18～60岁。空腹静脉采血,用本法测得血清1,5-AG 浓度为：(168±50)μmol/L,参考范围(±2s)为：68～268μmol/L,与文献[2-5]报告基本一致。

3 讨论

在建立血清1,5-AG 的匀相自动分析法的过程中,由于吡喃糖氧化酶底物特异性不佳,血清葡萄糖是需要重点排除的干扰物。Fukumura 等[2]、陈国军等[3]在测定1,5-AG 时,将葡萄糖通过葡萄糖激酶(GK)转化为6-磷酸葡萄糖,由于葡萄糖转化地不彻底,常导致1,5-AG 测定结果假性升高。冯景等[4-5]通过葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)将样品中葡萄糖(Glu)转化为6-磷酸葡萄糖内酯(G6PL),该法具有较好的抗干扰性,但当葡萄糖浓度大于44.4mmol/L 时仍然会对1,5-AG 的测定带来干扰。本文在用ATP 依赖性葡萄糖激酶(ATP-GK)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FDA)构建的酶法转化途径将葡萄糖分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛,结果表明,高达85.0mol/L 的葡萄糖水平也不会干扰本法测定。血清中的抗坏血酸和胆红素可以消耗反应过程中生成的过氧化氢而对1,5-AG 的测定具有负干扰,可以分别通过抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶等的作用得以消除。此外,目前文献报道的Trinder' s 反应色源多为N-乙基-N-2-羟基-3-磺丙基-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、2,4,6-三溴间羟基苯甲酸(TBHBA)等,显色后最大波长在550nm 及更短波长,抗三酰甘油、血红蛋白的能力并不强。在本文介绍的1,5-AG 测定试剂中,使用了一种新型的水溶性显色剂N-羧甲基氨基羰基-4,4-二甲基氨基-联苯胺(DA-64),吸收光谱扫描结果表明,标准管、测定管二者络合物最大吸收波长均在725nm,远离脂浊、血红蛋白等干扰物质的最大吸收峰,使测定试剂抗干扰能力进一步增强。

通过动力学曲线研究发现,线性范围的高低显著依赖于试剂R2 中PROD 酶的用量。R2 中PROD酶的浓度越小,反应到达终点所需的时间越长,方法的线性范围越窄;当R2 中PROD 酶为200KU/L时,550 μmol/L 的1,5-AG 可在加入R2 4分钟后达到反应终点。校准曲线测试表明,在本法选定的实验条件下测定1.5-AG,线性范围至少可达550 μmol/L(图1)。

为了观察本法的准确性,本文进行了回收率试验和方法对比试验,结果表明,本法的平均回收率为100.4%,测试结果与参考方法相比差异无统计学意义(P＞0.05),提示本法具有良好的准确性。此外本法也具有较高的灵敏度(LLD=1.05 μmol/L)和较好的重复性(批内和批间CV分别为1.03%～2.88%和1.87%～3.78%)。另外测定200例体检合格的成年人血清1,5-AG,其参考范围为68～268 μmol/L,与文献[2-5]报告基本一致;测定试剂置4℃开盖储存可稳定30 天,加盖储存可稳定12个月,具备临床实际推广应用价值。

[1]Yamanouchi T,Akanuma H,Asano T,et al.Reduction and recovery of plasma 1,5-anhydeio-D-glucitol level in diabetes mellius.Diabetes,1987,36：709

[2]Fukumura Y,Tajima S,Oshitani S,et al.Fully enzymatic method for determining 1,5-anhydro -D -glucitol in serum.Clin Chem,1994,40：2013

[3]陈国军,董金木,陆建红,等.血清1,5 脱水葡萄糖醇全酶的测定.中华医学检验杂志,1999,22(6)：358

[4]冯景,陶建蜀,吕军,等.一种新的全酶法测定1,5-脱水葡萄糖醇.检验医学,2005,20(6)：511

[5]商纯尔,郭真,陈青松,等.液体型吡喃糖氧化酶法试剂测定血清1,5-脱水葡糖醇.中国卫生检验杂志,2012,22(1)：172