多穗金粟兰粗提物提取方法的比较*

★ 罗杠 马兴霞 尹小英*

（江西中医学院 南昌 330004）

多穗金粟兰为金粟兰属植物（Choranthus multistachys Pei），又名四大天王、四块瓦、四叶细辛，是重要草药的一种，全草入药，性味苦辛，微温，有小毒，具有活血散瘀、祛风解毒的功效，被《本草纲目》所收载[1]。现代药理实验表明，金粟兰植物多具有抗菌抗肿瘤增强免疫抗病毒，抗溃疡，镇痛，抗血小板聚集等活性[2]。现在临床用于治疗跌打损伤、腰腿痛、疔肿、皮肤瘙痒等病症[3]。其中主要的活性成分为倍半萜内酯，目前已有単萜、倍半萜、二倍半萜及二萜报道[4]。为了充分提取倍半萜内酯活性部位，本实验比较了渗漉法、浸渍法和加热回流提取法，以浸膏得率和党参内酯含量为指标得最佳提取工艺，为相关活性部位的提取提供参考。

1 材料

1.1 药材

多穗金粟兰，购自江西樟树，经付小梅教授鉴定为多穗金粟兰植物。阴干的多穗金粟兰根粉碎成不同粒度的粉末，备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 高效液相色谱仪（美国Agilent 1200），分析电子天平（北京赛多利斯），旋转蒸发仪（上海亚荣）。

1.2.2 试剂 党参内酯标对照品（上海融禾，100716），乙腈（色谱纯，上海星可生化试剂公司），纯净水（娃哈哈，杭州娃哈哈集团），甲醇（色谱纯，上海星可生化试剂公司）、95%乙醇（分析纯，天津恒兴化学试剂公司）。

2 方法与结果

2.1 提取方法比较

2.1.1 加热回流提取法 取20、60、100目的粉末药材各10 g，用5、10、15倍量的95%的乙醇，提取时间为0.5、1、1.5h，分别提取3次，收集提取液，减压浓缩干燥，得干浸膏，计算浸膏得率，测定党参内酯的含量，计算党参内酯得率。试验选用粒度大小、溶媒体积和时间三因素三水平，采用L9（34）正交表安排实验。考察因素水平、实验结果及分析见表1-3。

表1 正交实验设计因素与水平

表2 正交实验方案及结果

表3 党参内酯得率方差分析

从表3方差分析结果表明，3个因素对提取无显著性影响，据表2中极差值可知，对提取影响程度依次为：A＞B＞C。在提取过程中，溶媒的量会影响提取效率，故选B3，在加热回流中，温度不宜过高，否则破坏有效成分，故选C1。最佳提取的组合为A3B3C1，即100的多穗金粟兰用15倍的95%的乙醇加热回流30分钟提取。

2.1.2 浸渍法 取20、60、100目的粉末药材各10g，用8、10、12倍量的95%的乙醇，提取时间为5、7、9天，分别提取2次，测浸膏量及测定含量。正交试验设计同“2.2.1”。考察因素水平、方案及结果和方差分析见表4-6。

表5 正交实验方案及结果

表6 党参内酯得率方差分析

从表6方差分析表明3个因素均无显著性差异。从表5极差值可知，影响因素的程度依次为：C＞A＞B。一般情况下，溶媒的量为药材的10倍量，故选B2。不同大小颗粒有不同程度影响提取效率，故选A3。最佳的提取组合为：A3B2C3，即100目的多穗金粟兰用10倍的95%的乙醇浸渍9d。

2.1.3 渗漉法 取20、60、100目的粉末药材各10 g，用10、15、20倍体积量的95%的乙醇，以2、4、6mL/min•kg的流速，测浸膏量及测定含量。正交实验安排同“2.2.1”。考察因素和水平、正交实验安排及结果和方差分析见表7-9。

表7 正交实验设计因素与水平

表8 正交实验方案及结果

表9 党参内酯得率方差分析

从表9方差分析和表8极差值表明在三个因素中，对党参内酯提取率的影响程度依次为：A＞B＞C。其中流速几乎不影响，但从时间角度考虑，故选C2。最佳的提取组合为：A3B2C2。

从3种提取方法结果可知，渗漉法和加热回流提取法效果最好，但在加热过程中，会破坏部分有效成分，故选择渗漉提取法，即用10倍量的95%的乙醇为溶剂，对100目的多穗金粟兰粉末以4 mL•min-1•kg-1流速进行渗漉。

2.2 党参内酯含量测定

2.2.1 色谱条件 依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相梯度：乙腈：水（0 min：15%：85%，10 min：60%：40%，23 min68%：32%，33 min 76%：24%，38 min：85%：15%，50 min：100%：0%）；流速：1 mL/min；柱温：30°；检测波长：220 nm；进样量：20 μL。

2.2.2 党参内酯标准溶液的配制 称取党参内酯标准品10 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，即得党参内酯标准溶液。

2.2.3 标准曲线的制作 取1mg/mL党参内酯标准品1、2 mL分别置于5 mL的容量瓶中，再另取党参内酯100ug/mL 500μL、1mL、2mL置于5 mL的容量瓶中，用乙腈定容。在220nm处进行高效液相检测，做成标准曲线，回归分析得到的标准曲线的方程为：Y=54.47X-65.124，r=0.9999.

2.2.4 样品党参内酯含量的测定 取样品约0.6 g，配制成2 mg/mL的溶液，取20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，用外标法计算党参内酯的含量。

2.2.5 精密度试验 取党参内酯标准品20 μg/mL的溶液，平行进样5次测其峰面积，其RSD值为3.1%。

3 讨论

3.1 含量测定方法

倍半萜内酯是多穗金粟兰的主要成分之一，其中党参内酯具有较好的抗癌活性[5]，但含量较低，有相关文献报道多穗金粟兰中党参内酯的含量的含量测定文献报道较少。因此，本实验选用党参内酯为对照品，于220 nm处测定党参内酯含量，并以此作为评价指标筛选最佳工艺，控制质量是可行的。

3.2 提取方法比较

从实验结果可知，浸渍法提取效果较差，渗漉法和加热回流提取法结果几乎相同。在渗漉法提取中，存在浓度梯度差，加热回流实验，高温度有利于溶出。故后两者的提取效果更好。

3.3 流动相的选择

实验中采用了水-甲醇和水-乙腈溶剂系统，两者都能得到很好的分离，但后者分离倍半萜内酯成分吸收值更大，吸收峰更多，并且基线更平稳。故选择选水-乙腈溶剂系统作为流动相。

[1]李时珍.本草纲目[M].北京：人民卫生出版社，1982，13：820.

[2]周伯庭.我国金粟兰属要用植物化学成分与药理作用的研究进展[J].中药材，2004，27（27）：539-542.

[3]喻庆禄，晏天宝，罗永明.多穗金粟兰的研究[J].中国现代应用药学杂志，2002，19（4）：327-328.

[4]冉新辉，倪伟，魏刚，等.多穗金粟兰中一个新的酚苷[J].云南植物研究，2010，32（1）：83-86.

[5]Masaaki U，Yutaka K，Genjiro K，et al.Studies on the Constitutents of Chloranthus spp.III Six sesquiterpenes from Chloranthus japonicus[J].Chemical＆Pharmaceutical BμLletin，1980，28（1）：92-102.