姜黄素通过抑制内质网应激和JNK通路过度活化减轻小鼠肺缺血再灌注损伤*

赵 珊， 马迎春， 刘亚坤， 周俊辉， 郝卯林， 陈海娥， 孙 勤， 王万铁△

近年来随着体外循环技术的不断开展，肺缺血/再灌注(ischemia reperfusion，I/R)所致的严重肺损伤越来越受到重视。研究提示，肺I/R过程中发生的氧化应激［1］、ATP 耗竭及细胞内钙稳态失衡［2］等因素将诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，适度的ERS有利于细胞恢复内环境稳态和维持存活，但持续或高强度的ERS则会导致细胞凋亡［3］，从而进一步加重肺I/R损伤。研究表明，干预细胞凋亡对I/R肺损伤具有一定的防治作用［4］。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中重要的通路之一，存在于多种生命活动过程中且易受多种细胞外应激因素激活并介导细胞凋亡［5］。随着对ERS研究的深入，已证实JNK信号通路参与介导了过度ERS中引发的细胞凋亡。

姜黄素(curcumin，Cur)是中药姜黄的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗肺动脉高压、抗肿瘤等［6-7］作用。临床研究发现，Cur在心［8］、脑［9-10］等多种重要器官的I/R损伤中发挥良好的保护作用［11］。因此我们推断，Cur可能对治疗肺I/R损伤也会有较好效果。目前的研究结果提示，Cur可能通过抑制ERS下的JNK通路发挥对肺的保护。本研究通过建立小鼠左侧原位肺I/R损伤模型，以Cur对I/R模型进行干预，探讨Cur能否通过抑制ERS下的JNK通路的过度活化来对抗肺I/R损伤，以期为Cur临床治疗肺I/R损伤提供实验依据和理论基础。

材料和方法

1 动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠60只，平均体重(20±2)g。由温州医学院实验动物中心提供［动物使用许可证号为SYXK(浙)2010-0150］。

2 主要试剂

姜黄素(Sigma)，In Situ Cell Death Detection Kit，POD(Roche)，逆转录试剂盒和PCR试剂盒(Fermentas Life Science);兔抗GAPDH多克隆IgG抗体(中国杭州贤至生物科技有限公司)，葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)Ⅰ抗、JNKⅠ抗和磷酸化JNK(p-JNK)Ⅰ抗(Cell Signaling Technology)，Ⅱ抗(辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物科技有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)，DAB显色试剂盒(×20)(北京中杉金桥生物科技有限公司)，DNaseⅠ(Sigma)，其余均为市售分析纯。

3 主要方法

3.1 动物模型复制 按照文献报道的方法复制小鼠原位肺 I/R模型［12］。小鼠经腹腔注射氯胺酮(0.1 mg/g)+赛拉嗪(0.01 mg/g)进行麻醉。切开气管，气管插管接小动物呼吸机，呼吸机参数设置为:潮气量0.6 mL，呼吸频率120 min－1，吸呼比3∶2。电热毯保温，监测体温。沿左胸骨断开第2、3肋骨，打开胸腔，暴露左肺，找到左肺门并以微型动脉夹夹闭30 min，即为缺血期;之后松开动脉夹，形成再灌注期，再灌注3 h。

3.2 Cur药物干预分组 按随机数字表法将实验动物分为6组，每组10只:sham组:只开胸不夹闭肺门，观察3.5 h后处死并取左肺;I/R组:阻断左肺门30 min，再灌注3 h，处死取左肺;I/R+DMSO组:于缺血前2 h经腹腔注射10%DMSO(20 mL/kg)，余同I/R组;I/R+Cur低、中、高剂量组:于缺血前2 h经腹腔注射不同剂量(低剂量为100 mg/kg，中剂量为150 mg/kg，高剂量为200 mg/kg)Cur溶液，余同I/R组。

3.3 肺湿干重比(wet/dry weight ratio，W/D)和总肺水含量(total lung water content，TLW)检测 取左肺上叶组织，用生理盐水漂洗，滤纸吸干水分，称重为湿重;在恒温电热鼓风干燥箱70℃24 h烘干后称重为干重，两者之比为肺W/D。TLW的计算公式如下:TLW=(W－D)/D。

3.4 肺组织光镜检测及肺泡损伤定量评估指数(index of quantitative assessment，IQA) 检测 按 文献［13］，取左肺下叶约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小肺组织，经4%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察各组标本组织学改变。在400倍视野下随机连续观察50个视野，计数每个视野下的总肺泡数及损伤肺泡数。肺泡内含红细胞或白细胞超过2个以上或肺泡内含有水肿渗出液的均视为损伤肺泡。把损伤肺泡数占总计肺泡数百分比的值作为IQA。

3.5 肺组织电镜检测 取左肺近肺门处约1 mm×1 mm×1 mm大小的肺组织若干小块，经2.5%戊二醛前固定，再依次经1%锇酸后固定，1%醋酸铀块染，酒精梯度脱水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，半薄切片和超薄切片，经醋酸铀和硝酸铅双重染色后，于电镜下观察各标本组织学改变结果。

3.6 RT-PCR检测JNK和GRP78 mRNA表达 Trizol法抽提总RNA，测定总RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再按照PCR试剂盒说明书进行cDNA扩增。引物序列见表1。PCR反应条件为:95℃ 1 min;95℃ 30 s，55℃(GAPDH)/56℃(JNK)/49 ℃(GRP78)30 s，72 ℃ 30 s，循环33次;72℃ 10 min。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.7 Western blotting检测 JNK、p-JNK 和 GRP78蛋白含量 将约100 mg肺组织块置研钵中并碾碎，加800 μL单去污剂裂解液(含PMSF)于研钵中，于冰上反复碾压使组织碾碎。取上清液，BCA法测定蛋白浓度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿式电转移法转移至PVDF膜，室温下用封闭液封闭2 h后加入Ⅰ抗JNK、p-JNK、GRP78单克隆抗体及兔抗GAPDH多克隆IgG抗体(1∶1 000稀释)，4℃反铺法过夜。分别加入1∶500Ⅱ抗，室温反应2 h。ECL化学发光，X射线底片曝光。

3.8 原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测肺组织细胞凋亡 按照试剂盒说明操作。细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞。计数5个高倍镜(×400)下的凋亡细胞数。凋亡指数(apoptotic index，AI)=检测到的凋亡细胞数÷5个高倍视野检测到的细胞总数×100%。

4 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示。正态分布数据的组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法，非正态分布数据进行Kruskal-Wallis检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组肺W/D、TLW和IQA的变化

与sham组相比，I/R组和I/R+DMSO组W/D、TLW及IQA均明显升高(P＜0.01)，且I/R组和I/R+DMSO组相比，W/D、TLW和IQA无显著差异(P＞0.05);与 I/R+DMSO组相比，I/R+Cur低、中、高剂量组W/D、TLW及IQA逐渐下降(P＜0.05或P＜0.01)，以I/R+Cur高剂量组降低明显(P＜0.05或P ＜0.01)，见表2。

表2 各组肺组织W/D、TLW、IQA及AI的变化Table 2.Comparison of W/D，TLW，IQA and AI of lung tissues in different groups(mean±SD.n=10)

2 各组肺组织形态学变化

Sham组肺间质及肺泡完整，未见炎症细胞浸润，见图1A。I/R组和I/R+DMSO组肺泡结构紊乱，肺泡壁水肿增厚或破裂，肺泡内水肿渗出或红细胞漏出或炎症细胞漏出，见图1B、C(粗箭头示炎症浸润，细箭头示肺泡内水肿)。I/R+Cur低、中、高各剂量组肺泡结构相对较完整，肺泡内水肿及炎症细胞浸润均有不同程度减轻，以I/R+Cur高剂量组减轻最为明显，见图1D、E、F。

Figure 1.Morphological changes of mouse lung tissues in various groups(×200).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.图1 各组肺组织形态学的变化

3 各组肺组织超微结构改变

由图2A可见，sham组毛细血管内皮细胞结构正常，基底膜完整，II型肺泡上皮细胞结构完整，线粒体嵴清楚，板层小体未见改变，微绒毛无减少。I/R组和I/R+DMSO组毛细血管内皮细胞肿胀，基底膜有断裂、不完整，线粒体肿胀，II型肺泡上皮细胞微绒毛脱落明显，核固缩，胞浆内板层小体数量减少、排空增多，肺泡隔水肿，肺泡隔及毛细血管内炎症细胞附壁增多，见图2B、C(粗箭头示板层小体，细箭头示微绒毛)。与I/R组及I/R+DMSO组相比，随着姜黄素剂量的逐渐增加，I/R+Cur各剂量组肺组织超微结构损伤逐渐减轻，肺泡结构和内皮细胞的超微结构清晰可辨，内皮细胞肿胀较轻，核染色质较均匀;肺泡Ⅱ型上皮细胞与邻近结构的界限明显，其表面微绒毛较多，基质中线粒体轻度肿胀，嵴较多，嗜锇性板层不多，肺泡隔结缔组织略增厚，以Cur高组最为明显，见图2D、E、F。

Figure 2.Ultrastructure changes of type II alveolar epithelial cells in different groups observed by electron microscopy(×10 000).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.图2 各组肺组织超微结构的变化

4 各组JNK和GRP78 mRNA水平表达的变化

GRP78 mRNA在sham组中低表达，在其余所有组别中均明显表达(P＜0.05);JNK mRNA在sham组中低表达，在I/R组、I/R+DMSO组和I/R+Cur各剂量组中均明显表达(P＜0.05)，但随着I/R+Cur剂量的增加，其表达量逐渐降低，以I/R+Cur高剂量组下降最为明显(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.The expression levels of GAPDH，GRP78 and JNK mRNA in mouse lung tissues in various groups detected by RT-PCR.A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group:E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;▲P＜0.05 vs I/R+DMSO group.图3 各组肺组织GRP78和JNK mRNA的表达水平

5 各组JNK、p-JNK和GRP78蛋白水平表达的变化

各组肺组织均可检测到JNK蛋白的表达，且表达量在各组间无明显差异。p-JNK蛋白在sham组中低表达，在I/R组、I/R+DMSO组和I/R+Cur各剂量组中均明显表达(P＜0.05)，但随着Cur剂量的增加，其表达量逐渐降低，以I/R+Cur高剂量组下降最为明显(P＜0.05);GRP78蛋白在sham组中低表达，在其余所有组别中均明显高表达(P＜0.05)，见图4。

Figure 4.The expression levels of GAPDH，GRP78，p-JNK and JNK proteins in mouse lung tissues in various groups detected by Western blotting.A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group:E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;▲P ＜0.05 νs I/R group.图4 Western blotting示各组肺组织GRP78和p-JNK蛋白的表达水平

6 各组肺组织细胞AI的改变

由图5、表2可见，sham组细胞凋亡数量较少;与sham组相比，I/R组和I/R+DMSO组细胞凋亡数量明显增多，细胞凋亡以肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞为主，AI亦明显升高(P＜0.01);I/R组与I/R+DMSO组相比，AI无显著差异(P＞0.05);与I/R组和I/R+DMSO组相比，I/R+Cur低、中、高剂量组细胞凋亡数量逐渐降低，AI亦逐渐下降(P＜0.05或P＜0.01)，以 I/R+Cur高剂量组下降最为明显(P ＜0.01)。

Figure 5.Apoptosis of mouse lung tissues in various groups detected by TUNEL method(×400).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.图5 各组肺组织细胞凋亡的情况

7 相关性分析结果

AI与 W/D、TLW、IQA、JNK mRNA 和 p-JNK 蛋白之间呈明显正相关关系(r分别为0.787、0.768、0.898、0.873 和 0.892，均 P ＜ 0.01，n=60)，与GRP78 mRNA和蛋白之间呈明显负相关关系(r分别为－0.306和 －0.341，均 P ＜0.05，n=60)。

讨 论

本研究观察到sham组肺组织少量细胞凋亡，I/R组和I/R+DMSO组出现大量的细胞凋亡，同时肺组织受损程度的敏感指标W/D、TLW和IQA均明显升高，光镜、电镜显示肺组织结构明显损伤，且肺细胞AI与W/D、TLW和IQA呈正相关关系，提示细胞凋亡参与了肺I/R损伤的发生。经Cur干预后，肺组织细胞AI、W/D、TLW和IQA降低，肺组织结构损伤减轻，表明Cur可能通过减轻细胞凋亡而治疗肺I/R损伤，保护肺组织。

缺血缺氧、葡萄糖/营养物质匮乏、ATP耗竭、氧化应激及Ca2+稳态破坏等因素均可引起ERS［14］，研究已证实，持续过强的ERS将引起ERS相关细胞凋亡，从而引起组织损伤。ERS需3种内质网跨膜蛋白——蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，Ire1)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)介导，正常情况下，这3种蛋白的内质网腔内侧都与GRP78结合而处于无活性状态。ERS发生时，GRP78即与这3种蛋白质解离，因此GRP78的急速上调被认为是ERS最敏感的标志［15］。解离的GRP78与未折叠/错误折叠蛋白质结合缓解内质网内未折叠蛋白负荷发挥保护作用。本实验结果显示，GRP78 mRNA和蛋白表达量在sham组很低，而肺I/R后表达明显上调，说明肺I/R诱导了过度ERS的发生，同时GRP78发挥着积极的保护作用。

MAPKs是存在于细胞浆内的一类具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点的蛋白激酶家族，参与细胞生长、增殖、分化等多种生理过程，并能将多种细胞外信号通过磷酸化传递到细胞核中，因此MAPKs信号通路是细胞外与细胞内信号转导的交汇点，是细胞内重要的信号转导系统。JNK信号转导通路是MAPKs信号通路中重要的通路之一，在多种生理、病理的程序性细胞死亡过程中起重要的调控作用。并且JNK通路与应激诱导型凋亡有关，可被多种细胞外应激(如缺血缺氧、细胞因子、应激等)激活而引起细胞凋亡，进而损伤组织。许多学者发现多种脏器I/R后，存在JNK的过度激活，且抑制JNK可改善I/R损伤。因此，深入探讨JNK在脏器I/R中的作用对于治疗肺I/R损伤具有重要意义。严重ERS时，活化的Ire1与TNF受体相关因子1(TNF receptor-associated factor 1，TRAF1)相连，其复合物募集凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)将激活JNK通路，引起细胞凋亡［16］。研究表明，乳鼠心肌细胞缺氧/复氧和心肌I/R中，心肌组织细胞再灌注损伤与GPR78和JNK表达增高有关［17］，缺血后处理通过抑制JNK通路对再灌注心肌发挥保护作用［18］。本实验观察到，肺I/R后JNK迅速活化，JNK mRNA和p-JNK蛋白表达明显上调。给予Cur预处理后，JNK mRNA表达和p-JNK蛋白表达呈剂量依赖性下调，且其表达量与细胞AI呈明显正相关关系。上述结果提示抑制JNK凋亡途径可能是减轻肺I/R损伤的途径之一;Cur可能通过抑制ERS中JNK信号转导通路的过度活化来拮抗肺I/R损伤。

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