Beta-adducin（Add2）基因rs3755351多态性与高血压遗传易感的相关性研究

耿启彬 李媛媛 李红 杨学习

高血压（hypertension）是一种以动脉血压持续升高为主要表现的慢性疾病，常引起心、脑、肾等重要器官的病变。50年来我国高血压患病率呈明显上升趋势,目前约有2亿高血压患者，每10个成年人中约有2人患高血压[1]。由于部分高血压患者并无明显的临床症状，又被称为人类健康的“无形杀手”，因此提高对高血压病的认识，早期预防、及时治疗有极其重要的意义。

内收蛋白（adducin，ADD）是一种细胞膜骨架蛋白，由α、β和γ三个亚单位组成异源二聚体。ADD不仅是细胞膜骨架的主要组成成分，而且还参与细胞信号传导及细胞膜离子转运，尤其与多种钠离子的转运机理密切相关。在高盐摄入与高血压之间存在的因果关系中，ADD是候选基因之一。在Milan高血压大鼠模型和人类中的平行研究表明ADD可通过增强组成型的肾小管对钠的重吸收来造成高血 压[2]。β-adducin共 有 64种 SNP[3]，rs3755351是ADD2基因内含子上一个A＞C变异位点。Kato等[4]通过对高血压的三层次、高密度的关联分析，从80 795个SNP位点中筛选出了9个与高血压易感有关的位点，其中rs3755351位点与高血压的易感有最显著的相关性（P= 1.7×10-5）。但目前ADD2 基因多态性与高血压遗传易感性特别是与发病风险的相关性研究还较少，也缺乏中国人群的研究数据。本研究采用病例-对照研究来探讨福建和广东人群ADD2 基因rs3755351位点多态性与高血压遗传易感性的相关性，以期为高血压的防控工作提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

样本为200 μL外周血，病例组来自2010年～2012年在福建和广州市疾病预防控制中心（CDC）确诊的高血压患者940例，男527例，女413例，平均年龄（60.2±16.2）岁，中位年龄62岁。对照组为同期入院的体检人员944名，无高血压遗传史，男497名，女447名，平均年龄（54.0±18.7）岁，中位年龄59岁。其中广州CDC病例组443例，男171例，女272例；对照组443例，男185例，女258例。平均年龄（69.2±10.7）岁，中位年龄68岁；福建病例组497例，男356例，女141例。对照组501例，男312例，女189例。平均年龄（46.2±15.6）岁，中位年龄45岁。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取

用全基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，北京天根生物科技有限公司）提取DNA（按说明书操作），保存于-70 ℃备用。

1.2.2 引物设计

针对染色体2p13区ADD2 基因rs3755351位点，采用Sequenom公司的软件Assay Design 3.1进行引物设计并由上海英骏生物公司（Invitrogen）合成。其中rs3755351 PCR特异性扩增引物为5'-ACGTTGGA TGCACACATTTTGTGTTCAGCG-3'；5'- CGTTGGAT GCTGAGATTATAAGTGGCTCC-3'；单碱基延伸引物为5'-CCCCCAGCGACAGTATCTCTTTA-3'。

1.2.3 SNP分型

利用MassARRAY®SNP分型技术对ADD2基因rs3755351位点进行基因分型。具体步骤如下：（1）PCR 扩增rs3755351位点所在的DNA片段：将提取纯化后的基因组DNA样品定量稀释，按设计顺序加1μL DNA 样品于384孔板上，然后添加4μL PCR扩增体系，使反应物的终浓度为1 U的Taq聚合酶，10 ng基因组DNA，各0.1μmol/L的PCR引物，500μmol/L dNTP。PCR 反应条件：95℃ 2 min，95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s 进行 45 个循环，72℃ 5 min。（2）虾碱性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）反应：添加0.5 U的SAP去除未反应完的dNTP，反应条件为37℃ 40 min，85℃ 5 min。（3）单碱基延伸反应：向SAP反应体系再加0.11μmol/L延伸引物，500μmol/L ddNTP，0.5 U 的 Thermosequenase DNA聚合酶。为了保持DNA聚合酶的活性，反应条件为94℃ 2 min，40 个循环的 94℃ 5 s，（52℃ 5 s, 80℃ 5 s）× 5个循环，72℃ ×3 min。（4）脱盐，质谱分析：反应产物用树脂脱盐后经自动点样仪点样于SpectroCHIP（Sequenom）芯片，点制后的芯片用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（SpectroREADER，Sequenom）检测，根据单碱基延伸的等位基因相对分子的量的不同进行基因分型。

1.3 统计学方法

用Haploview 4.1软件进行哈代-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验。应用χ2检验分析病例组和对照组中基因型的分布差异，用比值比（OR）及95% CI表示相对危险度。所有的统计检验均为双侧概率检验，数据采用SPSS 13.0软件分析。检验水准α= 0.05。

2 结果

2.1 ADD2 基因rs3755351位点3种基因型的特征质谱图及其分布

ADD2基因位于染色体2p13区域，rs3755351 是ADD2基因内含子上一个A＞C变异位点。在本研究人群中，rs3755351存在AA、AC、CC三种基因型，其特征图谱如图1。

ADD2基因rs3755351位点在对照组中AA、AC、CC三种基因型分布频率分别为14%、47%和39%。其中等位基因A和C的分布频率分别为37%和63%；在高血压病例组AA、AC、CC三种基因型的分布频率分别为13%、50%和37%，其中等位基因A和C的分布频率分别为38%和62%。两组之间的差异均无统计学意义（χ2=1.730，P=0.421；χ2=0.118，P=0.731），见表 1。

2.2 ADD2 基因rs3755351位点多态性与福建、广东高血压易感性的相关性

采用非条件Logistic回归分析，校正性别、年龄影响，评价rs3755351多态性与高血压遗传易感性的相关性。在隐性模型中，rs3755351位点AA和AC-CC基因型在福建高血压病例组中分布频率为10.5%、89.5%，与对照组（14.2%、85.8%）相比差异有统计学意义，与rs3755351 AC或CC基因型相比，携带AA基因型的个体能显著降低患高血压的发病危险（OR=0.65，95%CI：0.43～0.99，P=0.044），见表 2。Add2 基因的rs3755351多态位点AA、AC和CC基因型在广东高血压人群中的分布频率为15.1%、53.0%和31.8%，与对照组（12.4%、52.4%和35.2%）相比差异无统计学意义，P＞0.05，见表 3。

图1 ADD2 基因rs3755351位点的基因型特征质谱图Figure 1 of the AA, AC and CC polymorphism of rs3755351 in ADD2

表1 高血压组与对照组ADD2基因rs3755351位点多态性分布Table 1 Distribution of rs3755351 polymorphism in hypertension and control groups

表2 ADD2 基因rs3755351位点在福建人群中多态性分布及与高血压易感性的相关性Table 2 Frequency of rs3755351 in ADD2 genotype and risk of hypertension in Fujian population

表3 ADD2 基因rs3755351位点在广东人群中多态性分布及与高血压易感性的相关性Table 3 Frequency of rs3755351 in ADD2 genotype and risk of hypertension in Guangdong population

3 讨论

ADD2基因在染色体2p13上跨越了100 kb的区域，有17个外显子组成[5]。ADD2在脑、胎儿肝脏和肾脏中表达量最高[6]，是当环境强化时稳定组装新的突触和提高记忆力所必须的[7]。ADD2还是糖原合成酶激酶3（GSK3）的底物，β-adducin的磷酸化（通过GSK3途径）能有效地促进轴突在神经元中的生长[8]。β-adducin蛋白的突变能导致肾动脉肌张力的损伤[9]，还能通过调整特定的足突细胞蛋白表达参与肾小球病变的发展[10]。β-adducin缺失的小鼠表现为行为、运动协调和学习能力的丧失，伴随着α-adducin和γ-adducin蛋白表达水平和（或）磷酸化水平的改变，同时伴有海马体的长时程增强和抑制的损害[11]。Currie等[12]首先报道了ADD2基因的多态性和Ⅰ型糖尿病、糖尿病肾病的遗传易感性的相关性。

个体化是高血压治疗的趋势之一[1]，高血压候选基因变异可能影响血压水平对特定的降压药物治疗的反应，遗传变异的测量可能有助于确定高血压患者亚组中谁将会从特定的降压药物治疗中获得最大受益[13]。Ferrari等[14]发现一种新的降血压药物rostafuroxin能够拮抗与adducin和ouabain基因有关的高血压。Lanzani等也证实adducin和ouabain相关基因的变异能够预测抗高血压药物rostafuroxin的临床效果[15,16]。利尿剂在预防心肌梗死和脑卒中超过其他抗高血压药物疗法产生的类似降低血压的选择性优势，被认为可能支持旨在优化新的降压药物用于预防高血压相关器官损害的新战略[8]。然而，Kimura等[17]在半隔离的非裔巴西人群中通过对97个家庭的652例参与者分析ADD2（rs3755351）等7个基因位点的变异对原发性高血压的影响，没有发现所研究的单独变异与收缩压、舒张压或者和原发性高血压有关，仅发现有限的证据证明这些基因变异的多基因座效应对血压水平有影响，这些研究结果尚需要进一步的证实。

本研究采用病例-对照研究方法，通过对940例高血压患者和944名正常对照的ADD2基因rs3755351位点的基因分型发现，ADD2 基因rs3755351多态性位点与福建地区人群高血压的遗传易感性相关。与rs3755351 AC或CC基因型相比，携带AA基因型的个体能显著降低患高血压的发病危险。在广东人群中未发现rs3755351多态位点与高血压的遗传易感性相关。由于本研究仅局限于福建、广东地区人群，而SNP 位点的多态性在种族和地域上往往有较大的差异。因此，ADD2 基因rs3755351位点与高血压易感性的相关性尚需在中国其他人群中加以验证。

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