Graves病不同阶段病程中CD3-CD19+ B细胞含量变化

梁金明 欧志莲 陈聪 李青 刘永鹏 许琳

Graves病（Graves disease，GD）是一种常见内分泌异常疾病，与自身免疫性有关，在GD病程的早期或活动期，一直被认为是由辅助性T细胞（helper T cell，Th）2介导的体液免疫应答，Th1和Th2细胞因子所诱导的免疫反应又相互调节或交叉调节，近几年研究提示Th1免疫应答占主导[1]，随着治疗的干预和病程的发展，在缓解期或中晚期时，若Th1/Th2细胞的平衡被破坏，机体就会处于Th1优势或Th2优势漂移状态，造成病理性免疫反应。国外对GD的治疗主要以131I为主，国内对GD治疗以抗甲状腺药物（antithyroid drug，ATD）较多，但复发率高，给患者造成极大的精神负担和严重影响生活质量。引起这种自身免疫反应的因素还不清楚，病人机体的免疫应答及甲状腺功能的变化与机体免疫之间的关系也有待研究，而以T淋巴细胞中Th2细胞功能增强为主的体液免疫在GD的发病中具有非常重要的作用[2]，患者体内存在高水平的自身抗体。体液免疫B淋巴细胞的表面标志主要是白细胞抗原分化群CD3-CD19+（cluster of differentiation，CD3-CD19+），本研究通过检测正常人群、GD初发、缓解、完全缓解及复发患者CD3-CD19+占淋巴细胞比值变化，探讨GD病程不同阶段的B淋巴细胞及体液免疫状态。

1 材料与方法

1.1 标本收集与处理

在健康体检者中随机选择22例作正常对照组（简称正常组），根据《内科学》第6版Graves诊断标准分初次发现且未治疗病人33例（简称初发组），ATD治疗后缓解患者30例（TSH、TT3、TT4结果比初发现时有好转，简称缓解组），完全缓解患者12例（TSH、TT3、TT4结果完全正常，简称完全缓解组）及复发患者11例（TSH、TT3、TT4正常后再出现符合GD结果，简称复发组），其中男性39例，女性69例，年龄11～80岁。抽血2 mL用EDTA-K2抗凝全血，用流式细胞术检测CD3-CD19+占淋巴细胞比值。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 仪器

美国贝克曼库尔特公司FC500流式细胞仪。

1.2.2 试剂

CD3-CD19+试剂使用美国贝克曼库尔特公司生产tetraCHROME 45/56/19/3四色试剂盒。

1.3 方法

按试剂盒说明及仪器要求操作：缓慢混匀全血后取100μL加入流式仪专用试管中；吸取45/56/19/3四色试剂10μL加入混匀放室温避光孵育15 min；加500μL Optilyse C溶血素后放室温避光10 min；加500μL PBS室温避光10 min；1 500 rpm离心5 min，弃上清液；加1 mL PBS悬浮细胞上机检测。

1.4 统计学分析

用SPSS17.0软件对各组CD3-CD19+淋巴细胞百分比进行正态分布及方差分析（Student Newman Keuls Test），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

正常对照组CD3-CD19+结果为13.70±5.33，初发组结果为19.30±8.54，缓解组结果为15.70±5.91，完全缓解组结果为12.73±4.32，复发组结果为14.99±5.83，初发组明显高于正常对照组、缓解组、完全缓解组及复发组，差异有统计学意义（P=0.002、0.023、0.002、0.026）；其他各组比较虽有差异，但没有统计学意义。

3 讨论

B淋巴细胞是免疫系统中产生抗体的细胞，在机体的体液免疫中有重要作用，通过分泌抗体、抗原提呈、产生炎症因子及免疫调节因子、提供协同刺激信号、调节Th细胞分化途径及调节树突细胞功能等发挥其免疫调节功能，而Th细胞可以分泌多种细胞因子或表面因子受体，如白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、干扰素γ（IFNγ）等，介导体液免疫反应，通过中和毒素、激活补体等发挥体液免疫作用。Th1和Th2细胞因子所诱导的免疫反应相互调节或交叉调节，Th1/Th2细胞分泌的细胞因子维系着Th1/Th2细胞的平衡，如一旦Th1/Th2平衡被打破，Th1或Th2漂移使Th1或Th2为优势状态，从而造成病理性免疫反应。而不管是体液免疫应答还是细胞免疫反应都与Th1/Th2细胞的平衡有密不可分的关系。

B淋巴细胞分泌细胞因子或表面因子受体与某些效应物质等组成一个重要的网络系统，通过各种分泌形式，广泛而精细地调节甲状腺细胞的分化、生长和分泌功能，并参与自身免性GD的发生、发展过程。B 淋巴细胞功能的异常或数量的变化在体液免疫缺陷中有重要意义。在抗原刺激下，B细胞被激活，增殖形成生发中心，进一步分化为分泌抗体的浆细胞或长寿的记忆B细胞。CD3-CD19+是B细胞表面的糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，从B祖细胞开始表达，一直持续于整个B细胞成熟，在B细胞活化过程中不消失，CD3-CD19+高低代表B细胞水平[3]，在B细胞活化以及信号转导中起协同受体的作用， 参与B细胞的信号转导功能[4]及调节B细胞活化及增殖，在B细胞活化辅助受体中，CD3-CD19+发挥重要作用。所以CD3-CD19+反映B淋巴细胞的功能。B细胞数量增加和活化则是分泌自身抗体的基础，有研究表明GD病程发生发展中有自身抗体参与和器官特异性免疫损伤[5]。也有研究表明GD患者131I治疗后细胞免疫异常、协同刺激分子的表达有不同程度的改善，对机体的T、B细胞也有免疫调控作用[6]。

表1 方差分析均数两两比较表Table 1 Multiple comparison in ANOVA

表1结果显示初发组CD3-CD19+百分比值均高于于正常对照组、缓解组、完全缓解组及复发组，差异有统计学意义，P＜0.05（P分别为 0.002、0.023、0.002、0.026），说明体液免疫反应水平增强。缓解组结果与正常对照组比较虽没统计学意义，但数值比正常对照组高，说明体液反应水平还是比正常人有所增强。完全缓解组结果低于正常对照组，差异没统计学意义，但从数据比较中或者可以考虑经过治疗后，体液免疫反应水平比正常对照组有所减弱。而复发组结果与正常对照组比较虽没有统计学意义，但结果比正常对照组高，说明体液免疫反应水平又有所增强。从所有的结果来分析，从初发到缓解到完全缓解及复发全过程，CD3-CD19+的结果都与整个病程的免疫反应相一致。说明体液免疫反应在GD程中都起到很重要的作用，但对于是否因为ATD药物作用于免疫系统纠正免疫功能达到治疗GD效果，还是因为药物作用于甲状腺从而改善体液免疫反应的机理还有待更进一步的研究。同时，在治疗过程中，免疫功能特别是体液免疫如抗体、分泌的细胞因子对机体的损伤或影响也有待研究，其他研究显示属于体液免疫功能的抗体检测如甲状腺球蛋白抗体（anti-thyroglobulin antibody，TGAb）及甲状腺过氧化物酶抗体（antithyroid peroxidase antibody，TPO-Ab）的结果也说明了体液免疫反应在GD及其他自身免疫性甲状腺疾病中的重要作用及在这些疾病中诊断、治疗及预后提供重要依据[7～8]。

从表中数据提示复发组结果比初发组结果低，P＜0.05（0.026），差异有统计学意义，而稍高于正常对照组结果，但差异没有统计学意义，P＞0.05（0.782），应该也可以说明复发组病人的体液免疫反应水平由于免疫耐受或再次应答反应减弱造成；而完全缓解组结果低于正常对照组，差异虽没统计学意义，很可能是治疗过程中免疫反应受到抑制或免疫耐受所致。

然而，B淋巴细胞介导的体液免疫反应是一个非常复杂的过程，其活化、增殖、分化、免疫应答及应答耐受等都受到很多自身因素或药物等不可预知的因素或机制影响，因而CD3-CD19+结果在GD的诊断、防治中的作用也许有一定的局限性，但从数据分析中对于GD的诊断、治疗是有临床意义的，同时也引导我们作更深入的研究。

GD的发生机理及免疫功能反应复杂,通过更多的实验研究及随着体液免疫及B淋巴细胞的研究进一步发展和深入，如调节性B细胞（Breg）[9]、Toll样受体（TLR）[10]、易感染基因[11]、遗传因素[12]等研究所取得的成果，必定会为GD的致病机理及免疫作用作出更充分、更完善的诠释，为GD的诊断、治疗及预防或预防复发提供更充分的依据。

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