五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠睾丸氧化损伤的保护作用

2013-11-01刘苗苗张长城贾亮亮王洪武何毓敏

中成药 2013年12期

刘苗苗，张长城，贾亮亮，王洪武，曾晓，何毓敏，袁丁，王婷*

(1.三峡大学医学院，湖北宜昌 443002;2.三峡大学化学与生命科学学院，湖北宜昌 443002;3.三峡大学人民医院药剂科，湖北宜昌 443000)

环磷酰胺是一种临床常用的抗肿瘤药物，广泛应用于各种实体肿瘤和血液系统疾病的治疗，具有抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用［1］。环磷酰胺在抑制肿瘤细胞增殖的同时，也会影响人体正常细胞的增殖与分化，从而导致多种副作用，其中生殖毒性是环磷酰胺的主要毒副作用之一［2-3］。研究显示，腹腔注射环磷酰胺可使小鼠睾丸生精功能降低，精子凋亡数量增加，造成小鼠的弱精症［4］;环磷酰胺可导致睾丸组织内氧化-抗氧化系统的平衡破坏，抗氧化能力降低，自由基及其氧化产物过量产生，从而造成睾丸氧化应激损伤，提示氧化损伤可能是环磷酰胺导致生精功能障碍的主要原因之一［5-6］。

五子衍宗方由枸杞子、覆盆子、菟丝子(炒)、车前子(盐炒)、五味子(蒸)组成，有补肾益精的功效。现代药理研究显示，五子衍宗方具有调节体内性激素水平、改善生殖功能、增强免疫功能、抗氧自由基损伤等药理作用［7-9］。近期有研究显示，五子衍宗方可显著改善雷公藤多苷所致的大鼠的生精障碍，其作用机制与其改善支持细胞功能有关［10］;本课题组前期的研究显示，五子衍宗方可以显著改善环磷酰胺所致的小鼠生殖功能损害［11］，但其作用机制仍有待进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级的Balb/C种小鼠，8～9周龄，体质量22～25 g，湖北省实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。分笼饲养，环境温度(20±2)℃，相对湿度55%～65%，12 h光照，啮齿类动物饲料喂养，自由饮水。

1.1.2 药品与试剂五子衍宗方由40 g菟丝子、20 g覆盆子、40 g枸杞子、5 g五味子、10 g车前子组成，生药经三峡大学汪均植教授鉴定为正品。按照传统的方法煎取，将药液浓缩至粉末，提取率为18.8%，临用前配制成相应质量浓度的溶液。注射用环磷酰胺:购自江苏恒瑞医药股份有限公司。细胞凋亡检测试剂盒、兔抗小鼠Bax多克隆抗体、兔抗小鼠Bcl-2多克隆抗体、山羊抗兔SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒:购自武汉博士德生物工程有限公司。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和考马斯亮蓝试剂盒:购自南京建成生物工程研究所。Trizol、DEPC、即用PCR扩增试剂盒:购自生工生物工程(上海)有限公司。SOD1、SOD2、SOD3、GPX1、Bax、Bcl2以及 β-actin的引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物如下表1。精子营养液(BWW):NaHCO30.210 g/L、NaCl 0.554 g/L、乳酸钠0.370 g/L、CaCl20.025 g/L、KCl 0.0356 g/L、 KH2PO40.0162 g/L、 MgSO4·7H2O 0.0294 g/L、丙酮酸钠0.003 g/L、葡萄糖0.100 g/L、青霉素10000 U、质量分数0.5%的酚红1.0 mL、质量分数0.3%的 BSA。药品均为市售分析纯。

表1 Real time PCR引物序列及产物长度Tab.1 Primer sequences and product length of Real time PCR

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型制备 40只雄性SPF级的BalB/c小鼠，随机分为4组:空白对照组、模型组、五子衍宗方低、高剂量组。空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺50 mg/(kg·d)，连续注射7 d。然后空白对照组和模型组每天灌服生理盐水，五子衍宗方汤低、高剂量组分别给予五子衍宗方2 g/kg、4 g/kg，各组小鼠连续给药35 d。

1.2.2 小鼠生殖器官质量的测定末次给药24 h后，称小鼠体质量，断颈法处死小鼠，取出睾丸和附睾并称质量。

1.2.3 小鼠精子密度及精子活率的测定将盛有1 mL精子营养液的试管置于37℃恒温水浴箱中预热，取出单侧附睾，剪成三段放入试管中，颠倒摇匀，37℃，保温10～15 min，使精子充分游离，接着混匀后用微量移液器取10μL含精子的营养液，用牛鲍氏血细胞计数板计算每毫升的精子数。然后取1滴精子悬液，利用SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪进行精子活率的测定。

1.2.4 小鼠睾丸组织中SOD、GPX、MDA的检测称取100 mg睾丸组织倒入玻璃匀浆管中，加入900μL生理盐水，在冰上匀浆5 min，制备成10%的组织匀浆，3000 r/min离心15 min，然后取组织匀浆上清。按照说明书，用比色法测定睾丸组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性以及丙二醛(MDA)和组织中蛋白的水平。

1.2.5 小鼠睾丸组织中 SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA表达的检测取一侧睾丸组织放入玻璃匀浆器中，加入1 mL的Trizol在冰浴中匀浆，按照说明书方法提取RNA，依次加入5×g DNA E-raser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，总 RNA 1μL，补充 RNase Free dH2O，使总体积达 10μL，将混合液置42℃孵育2 min，置于冰上，除去基因组DNA。然后在反应管中依次加入5×PrimeScript® Buffer 2(for Real Time)4μL，PrimeScript® RT Enzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix 1μL，RNase Free dH2O 4μL，反应体系为 20μL。将反应管置于PCR扩增仪中37℃孵育15 min，85℃孵育5 s，将合成的cDNA置于-20℃保存。

在RNase Free处理过的反应管中加入2×PCR 12.5μL，DNA 模板 0.5μL，ddH2O(灭菌蒸馏水)11μL，最终反应体系为25μL。将样品放入PCR扩增仪中根据相应的条件扩增。取PCR产物10μL，加1× Loading Buffer 2μL，经2%的琼脂糖凝胶(含 EB 0.5μg/mL)电泳，电压为100 V，时间30 min，用紫外透射分析仪观察并拍照。

1.2.6 小鼠睾丸生精细胞凋亡的检测取睾丸组织，4%多聚甲醛固定、酒精梯度脱水，包埋后切片，TUNEL检测睾丸中各级生精细胞凋亡率。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选择10个视野，计算各个视野细胞凋亡指数。

1.2.7 小鼠睾丸组织中Bax、Bcl-2 mRNA表达的检测在RNase Free处理过的反应管中加入2×PCR 12.5μL，DNA 模板 0.5μL，ddH2O(灭菌蒸馏水)11μL，最终反应体系为25μL。将样品放入PCR扩增仪中按95℃预变性5 min、95℃变性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s条件扩增30次。

1.2.8 小鼠睾丸组织中生精细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的检测采用链霉素-生物素-过氧化物酶(SABC)法进行免疫组化检测，其操作步骤按SABC试剂盒的说明进行。在光学显微镜下观察，生精细胞间质出现棕黄色均质颗粒为阳性结果。显微图像采集系统对每张免疫组化切片随机选取5个高倍视野(×400)，利用Image Pro Plus 5.0专业图像分析软件计算阳性细胞染色的平均积分光密度(Average integrate optical density，AIOD)值，其Bax、Bcl-2的蛋白水平与平均积分光密度值成正比，即蛋白水平越高其平均积分光密度值越大。

1.2.9 统计学处理数据经SPSS 13.0软件处理，实验各个指标均用均数±标准差表示()，以单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异。

2 结果

2.1 五子衍宗方对小鼠生殖器官质量的影响模型组小鼠的睾丸和附睾质量及睾丸指数显著低于空白对照组，五子衍宗方低剂量和高剂量组均能显著增加小鼠的睾丸及附睾质量，对睾丸指数和附睾指数无显著性影响。模型组小鼠的精子密度和精子活率均显著低于空白对照组。五子衍宗方低剂量和高剂量组均可显著增加小鼠的精子活率及精子密度及。结果见表2。

表2 五子衍宗方对模型小鼠生殖器官指数及精子参数的影响(，n=8)Tab.2 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on genital index and sperm parameters in model mice(，n=8)

注:与空白组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01(下同)

组别睾丸质量/g睾丸指数/(mg·g-1)附睾质量/g附睾指数/(mg·g-1)精子密度/(106·mL-1)精子活率/%空白组 0.101±0.003 4.12±0.13 0.033±0.002 1.30±0.1392±12 68±8模型组 0.074±0.011# 3.13±0.44# 0.028±0.001# 1.17±0.20 27±6## 36±10##五子衍宗方低剂量组 0.085±0.009 3.18±0.57 0.029±0.001 1.04±0.08 62±13＊＊ 50±6*五子衍宗方高剂量组 0.093±0.013* 3.38±0.37 0.031±0.003* 1.07±0.06 65±21＊＊ 52±12*

2.2 五子衍宗方对模型小鼠睾丸内SOD、GPX活性及MDA水平的影响与空白对照组比较，模型组小鼠睾丸内SOD、GPX活性显著降低，MDA水平显著升高。五子衍宗方高剂量均可显著提高生精障碍小鼠睾丸内SOD、GPX活性以及降低MDA水平。结果见表3。

表3 五子衍宗方对小鼠睾丸内SOD、GPX活性及MDA水平的影响(，n=8)Tab.3 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on SOD and GPX activities and MDA content in mice testis(，n=8)

组别SOD/(U·mg protein-1)GPX/(nmol·mg protein-1)MDA/(nmol·mg protein-1)77±14 63±18 0.37±0.08模型组 61±7## 38±8## 0.59±0.18##五子衍宗方低剂量组 60±3 49±5 0.49±0.13五子衍宗方高剂量组 76±6＊＊ 86±12＊＊ 0.32±0.06空白组＊＊

2.3 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织内SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA表达的影响环磷酰胺对小鼠睾丸组织内SOD1的表达无显著性影响。环磷酰胺可以显著降低小鼠睾丸组织内 SOD2、SOD3、GPX1 mRNA的表达，五子衍宗方可显著上调SOD3和GPX1 mRNA的表达，对SOD2 mRNA的表达无显著影响。结果见表4。

2.4 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织内生精细胞凋亡的影响 TUNEL法如图1所示，空白对照组小鼠生精小管内各级生精细胞排列紧密，少见凋亡的生精细胞;模型组小鼠生精小管管腔内精子稀少，管壁细胞脱落，多见细胞核被染成棕黄色的凋亡的生精细胞。五子衍宗方各剂量组均能使小鼠生精小管各级生精细胞层次明显增多，凋亡细胞明显减少。结果见表5。

表4 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织内SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA水平的影响(，n=3)Tab.4 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on SOD1，SOD2，SOD3 and GPX1 mRNA levels in model mice(，n=3)

组别 SOD1/(U·mg protein-1)SOD2/(U·mg protein-1)SOD3/(U·mg protein-1)GPX1/(nmol·mg protein-1)0.98±0.21 1.83±0.57 2.28±0.32 2.18±0.28模型组 1.00±0.10 1.02±0.24# 1.00±0.23# 1.04±0.33##五子衍宗方低剂量组 1.16±0.26 1.00±0.20 1.80±0.66 1.79±0.08*五子衍宗方高剂量组 0.72±0.09 1.13±0.38 3.44±0.84＊＊ 1.79±0.38空白组*

图1 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织内生精细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of Wuzi Yanzong Decoction on spermatogenic cells apoptosis in model mice testis

表5 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织生精细胞凋亡的影响(，n=5)Tab.5 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on spermatogenic cells apoptosis in model mice testicular(，n=5)

组别生精细胞凋亡指数(AI)0.11±0.02模型组 0.37±0.04##五子衍宗方低剂量组 0.20±0.04*五子衍宗方高剂量组 0.17±0.02空白组＊＊

2.5 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织内Bcl-2及Bax mRNA表达的影响环磷酰胺所致小鼠睾丸组织中Bcl-2 mRNA表达显著下调，而Bax mRNA的表达显著上调。五子衍宗方可以上调Bcl-2mRNA的表达，降低Bax mRNA的表达。结果见图2。

图2 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织中Bcl-2及Bax mRNA水平的影响Fig.2 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax mRNA levels in model mice testis

2.6 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织中生精细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 Bcl-2免疫组化的结果发现，空白对照组Bcl-2表达明显，生精细胞胞浆内呈弥漫性棕黄色染色。模型组生精细胞胞浆内Bcl-2表达微弱，仅见少量浅黄色染色。五子衍宗方各剂量组生精细胞Bcl-2的表达明显增多，与模型组比较有显著性差异。

Bax免疫组化结果显示，模型组生精细胞胞浆呈弥漫性的棕黄色染色，与空白对照组比较，具有显著性差异。五子衍宗方组中生精细胞胞浆内Bax的表达较模型组减少，部分胞浆内可见弥漫性的浅黄色染色。

统计结果见表6，模型组Bcl-2/Bax比值较空白对照组显著下降(P＜0.05)，五子衍宗方可显著上升Bcl-2/Bax的比值，并具有统计学意义(P＜0.01)。结果见图3、图4。

表6 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织生精细胞Bcl-2和Bax蛋白水平的影响(，n=5)Tab.6 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax protein levels in model mice testis(，n=5)

组别 Bcl-2 AIOD值 Bax AIOD值 (Bcl-2/Bax)2083.38±662.41 172.34±59.39 13.87±4.62模型组 783.00±87.29## 2378.16±738.50## 0.35±0.09#五子衍宗方低剂量组 1272.34±145.21 1106.92±213.41 1.16±0.22*五子衍宗方高剂量组 1964.48±471.32＊＊ 643.27±78.34＊＊ 3.05±1.70正常组＊＊

图3 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织中生精细胞Bcl-2蛋白表达的影响Fig.3 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax protein levels in model mice testis

图4 五子衍宗方对模型小鼠睾丸组织中生精细胞Bax蛋白水平的影响Fig.4 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bax protein levels in spermatogenic cells in model mice testis

3 讨论

环磷酰胺是一种广谱的抗肿瘤药物，其机制主要是通过其代谢产物磷酰胺氮芥和丙烯醛对DNA、RNA和蛋白质的烷化作用从而干扰细胞内的多种生物学功能，从而导致大量的毒副作用，生殖毒性是目前越来越引起人们关注的环磷酰胺的主要副作用之一［12］。有研究表明，氧化损伤是环磷酰胺导致生殖功能障碍的主要原因之一。精子细胞膜中含有大量的不饱和脂肪酸，并对脂质过氧化以及活性氧自由基诱导的损伤高度敏感。睾丸组织在环磷酰胺的作用下时，产生大量的活性氧和自由基，破坏该组织的氧化还原平衡，从而影响生殖功能［13］。

SOD和GPX是体内抗氧化酶系统中两个重要的酶。SOD主要存在于胞浆和线粒体中，在细胞外液中也有少量存在。SOD歧化超氧阴离子为H2O2，H2O2在过氧化氢酶作用下转化为H2O和氧分子，从而减弱超氧阴离子的氧化损伤。GPX广泛存在于机体内各个组织，它的生理功能主要是催化谷胱甘肽(GSH)参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用［14-15］。MDA是自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物之一，其水平可间接反映机体内细胞脂质过氧化的程度。

本实验结果显示，当给予小鼠环磷酰胺后，其睾丸和附睾质量、精子密度及精子活率显著低于空白对照组，且睾丸组织中SOD、GPX活性显著降低，MDA水平显著升高，SOD2、SOD3、GPX1 mRNA的表达显著下调。五子衍宗方能增加模型小鼠的睾丸和附睾质量，提高精子密度和活率，且可显著降低睾丸组织中MDA水平，提高SOD和GPX活性，上调SOD3、GPX1 mRNA的表达，以上实验结果表明五子衍宗方可以减轻环磷酰胺对睾丸组织造成的氧化损伤，从而保护生精细胞的功能。

Bcl-2家族是以Bcl-2为代表的一组凋亡调节蛋白，在凋亡的调节中起着关键作用。这类蛋白有调节凋亡的两种对立功能，当抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl与促凋亡蛋白如Bax、Bid的比值升高时发挥抗凋亡的作用，反之，发挥促凋亡作用。所以，这类蛋白的比值高低是决定细胞存活与凋亡的重要因素［16］。本实验研究显示五子衍宗方可以显著上调睾丸组织Bcl-2基因及蛋白的表达，下调Bax基因及蛋白的表达，增加Bcl-2/Bax比值;表明五子衍宗方可以通过调节Bcl-2、Bax表达来拮抗环磷酰胺对睾丸组织生精细胞诱导的凋亡。

综上所述，五子衍宗方可以显著拮抗环磷酰胺所诱导的睾丸氧化损伤与生精细胞凋亡，其机制可能与上调睾丸组织中SOD3、GPX1 mRNA的表达，提高睾丸组织中SOD和GPX的活性以及降低MDA水平，调节氧化-抗氧化系统的平衡有关;其作用机制还可能与上调睾丸组织中Bcl-2基因表达，下调睾丸组织中Bax基因表达，增加Bcl-2/Bax比值，从而拮抗环磷酰胺所诱导的生精细胞凋亡有关。

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