莪术油诱导卵巢癌顺铂耐药细胞凋亡及对STAT信号传导通路的影响

李荣霞，刘首娟，孔德胜，李 敏，李艳芳，史淑红，

(河北医科大学第二医院，河北石家庄 050000)

莪术油是从姜科植物莪术的干燥根茎中提取的挥发油成分，味辛、苦，性温，归肝、脾经，具有破血行气、消积止痛之功。莪术中富含挥发油，且成分相当复杂，主要化学成分为β-香烯、莪术醇、莪术酮、新莪术二酮、樟脑和异莪术醇等［1］。其具有很好的抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓形成和增强免疫功能等［2-4］广泛的生物学效应，尤其是其抗肿瘤作用受到广泛关注。杨美春等［5］研究表明，莪术油对人卵巢癌SKOV3细胞具有增殖抑制作用。但对卵巢癌耐药细胞株是否有作用目前尚未见报道。

信号传导子与转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)异常表达与肿瘤细胞的化疗药物有关，Rosen等［6］发现STAT3和Bcl-xl高表达的卵巢癌细胞系SKOV3对顺铂不敏感，而STAT3低表达的卵巢癌细胞系A2780对化疗药物敏感，实验表明:肿瘤细胞中STAT3高表达于化疗耐药有关。Gu等［7］研究发现肿瘤组织中STAT3异常高表达与顺铂化疗耐药相关，并通过体外研究发现阻断STAT3信号通路可恢复肿瘤细胞对顺铂化疗的敏感性。抑制STAT3信号通路可以使耐药肿瘤细胞增敏，STAT3通路及其调控的下游靶基因可以作为肿瘤对化疗耐药的标志［8-12］。实验拟通过体外实验将莪术油作用 SKOV3/DDP评估其抗肿瘤作用，并初步探讨其对STAT3信号传导通路的影响，为耐药性卵巢癌的临床治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP购自上海生物工程公司。该细胞系耐药倍数是亲代株的4.3倍，此细胞系在加药冻存及连续无药培养条件下可分别保持3个月及6个月的稳定耐药性。

1.1.2 主要药物及试剂 莪术油注射液(徐州莱恩药业有限公司，规格:10 mL/支:莪术油0.1 g/支，国药准字H20067076);顺铂(山东齐鲁制药厂，规格:10 mg/支，国药准字H37021358);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司);RPMI1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);Actived Caspase-3抗体、STAT3抗体、兔抗人Survivin抗体(Bioworld公司产品);山羊抗兔IgG抗体、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);噻唑蓝(美国Sigma公司);RNA提取试剂盒(Invitrogen公司);引物(赛百盛公司)。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱(上海力申科学仪器公司);超净工作台(苏州净化设备有限公司);台式离心机(科大创新股份有限公司);酶标仪MN3型(Labsystems Dragon Well Scan);倒置显微镜(日本 OLYMPUS);数码相机(日本 OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SKOV3/DDP细胞置于含10%胎牛血清、1μg/mL顺铂、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔48 h换液1次，约3～5 d经0.4%胰蛋白酶消化以1∶3的比例传代。顺铂用生理盐水配成20μg/mL贮存液，－20℃保存，使用时需要用含10%小牛血清的RPMI1640培养液配成工作液。

莪术油作用于 SKOV3/DDP细胞的IC30为37μg/mL之间，顺铂作用于SKOV3/DDP细胞的IC30在10与20μg/mL之间，预实验显示莪术油与顺铂联用具有协同作用，依据文献选用15μg/mL［13］。

1.2.2 MTT法测定SKOV3/DDP细胞的增殖活性

将细胞密度为5×104个/mL接种于96孔板，待细胞达到对数生长期后吸去培养液，分别加入含10%胎牛血清RPM11640配制的质量浓度为0、16、32、64、128、256μg/mL 莪术油 0.2 mL/孔，各设3个复孔;分别培养24、48 h后弃上清，加入5 mg/mL的MTT(PBS液配制)20μL，继续培养4 h，弃掉培养液，各孔加入0.15 mL DMSO，振摇10 min，酶标仪490 nm处测定各孔吸光度D490的值，并记录结果。实验重复3次，计算实验组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=［1－(实验孔 D490值 －空白孔 D490值)/(对照孔D490值 －空白孔D490值)］×100%

1.2.3 免疫组化法 将盖玻片放入12孔板中，然后将处于对数生长期的细胞，以5×104mL接种到12孔板中，待24 h细胞贴壁后，按15μg/mL顺铂、37μg/mL 莪术油、15μg/mL 顺铂联合 37μg/mL莪术油加入到12孔板中，同时设空白对照。培养24 h后，丙酮固定30 min，实验方法参考文献［15］。使用Image-Pro Plus 6.0软件分析400倍所拍的照片，分析前进行阳性目标的彩色分割、编辑，得到满意图形图像后，选择相应的区域，测量其积分光密度(IOD)及测量面积，以IOD值除以测量面积，计算平均光密度(mean density)，高倍镜下选取10个视野，每张片子计算10次平均光密度值。

1.2.4 RT-PCR检测莪术油对SKOV3/DDP细胞STAT3及其下游靶基因的表达情况 参照NCBIGeneBank的基因序列，运用Primer Primer 5.0软件设计引物(见表1)。具体过程参考文献［16］，扩增条件见表2，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，UVP紫外凝胶分析系统摄像，利用Quantity one图象分析软件行灰度值分析并保存结果。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 反应条件Tab.2 PCR reaction conditions

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计算P值。两组间均数比较采用t检验，两组以上均数比较应用单因素方差分析和非参数检验)，数据以表示，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 MTT法检测莪术油对SKOV3/DDP细胞增殖抑制情况 实验结果显示16、32、64、128、256μg/mL莪术油作用于卵巢癌SKOV3/DDP细胞后，随药物质量浓度增加，其对细胞有明显的抑制作用且呈现出明显的时间-剂量关系。药物作用24 h后，抑制率分别为 13.9%、24.6%、59.7%、86.0%、96.2%;作用 48h抑制率分别为21.77%、29.72%、49.04%、54.67%，统计结果显示对照组与各质量浓度组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3、图1。

表3 不同质量浓度莪术油对SKOV3/DDP的增殖抑制率()Tab.3 Inhibition rates of the different concentrations of Zedoary Oil to the SKOV3/DDP cells()

表3 不同质量浓度莪术油对SKOV3/DDP的增殖抑制率()Tab.3 Inhibition rates of the different concentrations of Zedoary Oil to the SKOV3/DDP cells()

注:不同质量浓度莪术油作用于SKOV3/DDP吸光度值比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

药物质量浓度/(μg·mL－1 24 h 48 h)光密度值 增殖抑制率 光密度值 增殖抑制率0(对照组)0.173±0.008 0.201±0.00716 0.160±0.002 0.139* 0.171±0.005 0.205*32 0.149±0.006 0.246* 0.152±0.003 0.336*64 0.116 ±0.004 0.597* 0.104 ±0.003 0.662＊＊128 0.091 ±0.004 0.860＊＊ 0.072 ±0.002 0.882＊＊256 0.082±0.003 0.962* 0.059±0.001 0.976*

2.2 免疫组织化学法检测细胞内相关蛋白的表达情况 表4及图3示，终质量浓度为15μg/mL顺铂，39μg/mL莪术油，及其二者联合作用于卵巢上皮细胞癌SKOV3/DPP检测结果显示STAT3各组的表达有差异，Survivin结果显示各组间比较有差异，各组间表达有差异，Caspase-3各组间表达有区别。均为P＜0.01差异有统计学意义。

Spearman相关系数分析SKOV3/DPP细胞中STAT3与Survivin蛋白的相关系数为0.883，P=0.000＜0.01，呈正相关关系，有统计学意义;STAT3与 Caspase-3蛋白的相关系数为 －0.878，P=0.000＜0.01，呈负相关关系，有统计学意义。

图1 不同质量浓度莪术油作用SKOV3/DDP 48 h后细胞形态变化(100×)Fig.1 Morphological changes of SKOV3/DDP cells after being treated with different concentrations of Zedoary Oil for 48 hours(100×)

图2 莪术油、顺铂、莪术油联合顺铂作用于SKOV3/DDP 24 h后STAT3，Survivin，Caspase-3免疫组化结果(400×)Fig.2 Expression of STAT3，Survivin，VEGFC，Caspase-3 protein in SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by immunohistochemistry

表4 SKOV3/DDP胞浆或胞核中STAT3，Survivin，Caspase-3蛋白表达()Tab.4 Expression of STAT3，Survivin protein in the cytoplasm and cell nuclear of SKOV3/DDP cells()

表4 SKOV3/DDP胞浆或胞核中STAT3，Survivin，Caspase-3蛋白表达()Tab.4 Expression of STAT3，Survivin protein in the cytoplasm and cell nuclear of SKOV3/DDP cells()

注:不同组别两两比较，＊＊P＜0.01

组 别平均光密度值空白对照组 15μg/mL顺铂 37μg/mL莪术油 顺铂+莪术油STAT3 1.057±0.130 0.781±0.078＊＊ 0.639±0.061＊＊ 0.117±0.019＊＊Survivin 1.008±0.125 0.771±0.119＊＊ 0.580±0.064＊＊ 0.139±0.044＊＊Caspase-3 0.338±0.050 0.593±0.069＊＊ 0.732±0.067＊＊ 0.905±0.097＊＊

2.3 RT-PCR检测卵巢癌细胞相关蛋白表达变化情况 SKOV3/DDP细胞STAT3、Survivin表达量的变化:15μg/mL顺铂组STAT3 mRNA表达量与对照组比较吸光度比值有所下降，但差异没有统计学意义(P＜0.05);37μg/mL莪术油组 STAT3、Survivin表达量与对照组比较表达下降，差异有显著性(P＜0.05)。莪术油 +顺铂组 SKOV3/DDP细胞的STAT3、Survivin与对照组比较明显下降，差异有显著性(P＜0.05)。联合用药与顺铂组、莪术油组比较差异均有显著性(P＜0.05)。15μg/mL顺铂组与37μg/mL莪术油组比较有差异，莪术油组抑制作用明显，见图3。

SKOV3/DDP细胞Caspase-3 mRNA表达量的变化:15μg/mL顺铂组STAT3 mRNA表达量与对照组比较吸光度比值增强，差异有统计学意义(P＜0.05);37μg/mL莪术油组Caspase-3 mRNA表达量与对照组比较表达上调，差异有显著性(P＜0.05)。莪术油 +顺铂组 SKOV3/DDP细胞的Caspase-3 mRNA与对照组比较明显增强，差异有显著性(P＜0.05)。联合用药与顺铂组、莪术油组比较差异均有显著性(P＜0.05)。15μg/mL顺铂组与37μg/mL莪术油组比较有差异，莪术油组抑制作用明显，见图3。

Spearman相关系数分析SKOV3/DPP细胞中STAT3与Survivin蛋白的相关系数为0.836，P=0.000＜0.01，呈正相关关系，有统计学意义;STAT3与 Caspase-3蛋白的相关系数为 －0.857，P=0.000＜0.01，呈负相关关系，有统计学意义。

表5 RT-PCR技术检测莪术油，顺铂及其二者联合作用SKOV3/DDP细胞STAT3 Survivin，Caspase-3 mRNA的表达Tab.5 Expression of STAT3，Survivin Caspase-3 mRNA in the SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR()

表5 RT-PCR技术检测莪术油，顺铂及其二者联合作用SKOV3/DDP细胞STAT3 Survivin，Caspase-3 mRNA的表达Tab.5 Expression of STAT3，Survivin Caspase-3 mRNA in the SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR()

注:不同组别间两两比较，＊＊P＜0.01

组 别平均光密度值空白对照组 15μg/mL顺铂 37μg/mL莪术油 顺铂+莪术油STAT3 0.913±0.089 0.835±0.021＊＊ 0.723±0.050＊＊ 0.597±0.025＊＊Survivin 0.850±0.064 0.841±0.032＊＊ 0.723±0.050＊＊ 0.572±0.049＊＊Caspase 0.505±0.015 0.586±0.034＊＊ 0.633±0.047＊＊ 0.808±0.044＊＊

图3 RT-PCR检测莪术油、顺铂、莪术油联合顺铂作用于 SKOV3/DDP 24 h 后 STAT3，Survivin，Caspase-3表达情况Fig.3 Expression ofSTAT3， Survivin， VEGFC，Caspase-3 mRNA in SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，死亡率高，五年生存率仅20%～30%。由于卵巢位于盆腔深部，早期病变不易发现，一旦出现症状多为晚期。目前，卵巢癌的治疗方法主要是肿瘤细胞减灭术及术后正规足量联合化疗，可明显提高患者带瘤生存率。受经济条件的限制，以顺铂为基础的联合化疗仍是部分患者首选的化疗药物，但在化疗过程中患者表现出不同程度的获得性耐药及严重的毒副作用，是导致卵巢癌化疗耐药、未控的重要因素。延长生存时间，提高患者的生存质量，寻找低毒、高效的抗肿瘤药物一直以来是广大学者研究的热点。

天然中药低毒、高效，具有独特的优势。研究证实莪术油不仅能直接抑制、破坏肿瘤细胞，还可诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、增强机体自身的免疫功能［17］，能较好地直接干预或辅助治疗恶性肿瘤［2］。实验通过显微镜，MTT实验证实莪术油对SKOV3/DDP细胞增殖具有抑制作用。流式细胞技术检测发现莪术油联合顺铂所用于SKOV3/DDP细胞后，细胞凋亡率明显增高，但其逆转耐药的相关机制尚无研究报道。

本实验以SKOV3/DDP细胞作为研究对象，利用MTT法观察不同质量浓度莪术油对细胞增殖的影响。为进一步了解其对STAT3信号通路的影响，初步探讨可能作用机制，采用免疫组织化学法，RT-PCR法检测莪术油对STAT3信号通路及下游靶基因相关蛋白表达的影响，同时采用顺铂、莪术油联合顺铂作用于SKOV3/DDP细胞后观察莪术油对SKOV3/DDP细胞中STAT3信号通路及下游靶基因相关蛋白影响。免疫组化结果发现卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP细胞中STAT3，Survivin表达增高，Caspase-3表达下调。莪术油联合顺铂作用SKOV3/DDP细胞后细胞增殖抑制作用较莪术油单独使用更加明显。RT-PCR结果显示顺铂，莪术油及其联合作用于细胞SKOV3/DDP后各组间STAT3、Survivin蛋白的表达具有明显差异，且P＜0.05差异具有统计学意义。同时统计结果显示STAT3的表达与Survivin呈正相关关系，与Caspase呈负相关关系，P＜0.01差异具有统计学意义。莪术油与顺铂联合应用具有协同或叠加增敏作用。本实验结果显示莪术油对SKOV3/DDP细胞的增值抑制作用可能影响STAT3信号传导通路及其下游靶基因蛋白的表达。

正常情况下STAT3蛋白的激活快速而短暂，肿瘤组织中STAT3持续激活从而导致其下游靶基因的异常激活，下游靶基因如Survivin、caspases、cmyc等均已证实与细胞增殖、分化、恶性转化、凋亡抑制等病理生理过程密切相关［18］。Gu等［7］研究发现肿瘤组织中STAT3高表达与顺铂耐药相关，并进一步研究发现通过阻断STAT3信号通路可恢复肿瘤细胞对顺铂的敏感性。Survivin作为凋亡抑制基因，几乎在所有的恶性肿瘤中均有表达，其过量表达与肿瘤耐药有关［19］，化疗药物可通过诱导Survivin的表达上凋，上调的Survivin可与Caspases特异性结合，抑制Caspase-3和Caspase-7的活性从而阻断多种凋亡信号诱导细胞凋亡，从而导致肿瘤耐药的形成［20］。实验结果与上述报道一致。

实验研究显示，莪术油对人卵巢癌顺铂耐药细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用;莪术油作用于SKOV3/DDP细胞后，STAT3及其下游靶基因表达Survivin、Caspase-3表达降低从而逆转卵巢癌顺铂耐药细胞的耐药性。莪术油可增强SKOV3/DDP对顺铂敏感性，其相关机制可能与STAT3信号传导通路有关，但仍需进一步深入临床研究。

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