齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞及P450酶的影响

汤 浩，刘晓莉，王 锐，高庆剑，陆 铖，孙志博

(1.甘肃省人民医院药剂科，甘肃兰州 730000;2.宁夏医科大学药学院药理系，宁夏银川 750000;3.兰州大学基础医学院遗传所，甘肃兰州 730000)

人体内主要药物代谢酶是细胞色素P450家族，其中CYP1A1、CYP3A4是主要的诱导酶，前者能催化许多前致癌物转化为致癌物［1］，后者代谢60%临床常用药物［2］，它们是药物代谢/毒理学的重要指标。齐墩果酸临床上主要用于治疗急性黄疸型和慢性中毒性肝炎，并作为抗癌辅助药物。经研究齐墩果酸具有保肝作用［3-4］，并且能够诱导肝癌细胞HepG2细胞的凋亡［5］。绿原酸具有广泛的药理和生理活性，主要存在于杜仲，金银花等植物中。有文献报道，绿原酸具有抗肝纤维化和肝损伤的作用［6］，绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作用［7］，利福平是肝脏CYP450酶某些同工酶的诱导剂和抑制剂，影响其他药物代谢［8］。因此本实验选取齐墩果酸和绿原酸为研究对象，探讨它们对HepG2细胞增殖、细胞周期、CYP1A1mRNA、CYP3A4 mRNA的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 齐墩果酸和绿原酸均购自中国药品生物制品检定所，供定量测定用。利福平(上海化学试剂有限公司)。采用二甲基亚砜(DMSO)助溶，DMSO在细胞液中的终浓度不超过0.1%。TaKaRa RNAiso Plus购自宝生物工程(大连)有限公司;Rever Ace qPCR RT Master Mix购自TOYOBO公司;实验所用引物用Primer Premier 5.0软件设计，委托上海生工合成;新生牛血清购自PAA公司;噻唑蓝(MTT，美国 Sigma公司)。一次性细胞瓶(5×5 cm2)，细胞培养皿(100 mm)，96孔细胞培养板全部购自NUNC公司。

1.2 仪器 超净台，细胞培养箱，ABI7500实时荧光PCR，梯度 PCR测定仪(购自 PCR公司)，高速低温离心机(SIGMA公司)，核酸蛋白测定仪。

1.3 HepG2 细胞株人肝癌细胞HepG2为本实验室保存。HepG2接种于含10%新生牛血清、抗生素(100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM高糖培养基中。HepG2细胞培养环境:5%CO2、37℃、相对湿度90%。HepG2细胞取对数生长期细胞用作实验。

1.4 MTT方法 取对数生长期细胞，调整密度为5×104个/mL接种于96孔板中，100μL/孔，16 h后加入含不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸和利福平的培养基，药物终质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL，每个质量浓度设5个复孔，同时设空白对照组和正常细胞生长组，药物作用24 h后，加入5 mg/mL MTT，20μL/孔，继续培养4 h后弃上清，加入DMSO 150μL/孔溶解，震荡混匀10 min，在酶联免疫检测分析仪上测定A490nm值。按以下公式计算药物细胞生长抑制率，实验以3次平行实验数据为最终结果。

细胞生长抑制率=(1－A实验/A对照)×100%

1.5 细胞周期测定 取对数生长期的细胞，按1×106个/瓶接种于一次性细胞培养瓶，培养16 h后，用PBS清洗两遍，加入含不同质量浓度药物齐墩果酸和绿原酸的培养基，药物质量浓度分别为100、50、25μg/mL，阳性对照利福平 10μg/mL，继续培养24 h后，胰蛋白酶消化成单细胞液，收集细胞，用PBS洗涤细胞后，加入300μL PBS，再加入 －20℃预冷的无水乙醇 700μL，混匀，－20℃冰箱固定24 h以上，离心洗涤细胞后，加入终质量浓度20μg/mL的RNA酶，置于37℃水浴30 min，接着加入50μg/mL PI 300μL避光染色30 min，300目筛网过滤，2 h内流式细胞仪分析细胞周期。

1.6 齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞中CYP1A1、CYP3A4 mRNA表达的影响

1.6.1 分组 实验组，齐墩果酸和绿原酸质量浓度为100、50、25μg/mL;阴性对照组，正常细胞生长组，阳性对照利福平10μg/mL。

1.6.2 RNA的提取和cDNA的合成 细胞接种于一次性细胞培养瓶，16 h后吸取旧的培养基，用PBS清洗两遍，加入含不同质量浓度两种药物的培养基，药物作用时间为24 h。用RNAiso Plus试剂盒提取RNA之后，用核酸蛋白测定仪检测A260/A280比值，鉴定 RNA的纯度。RNA溶解于15μL RNse-free H2O中，5μL用于测定 RNA的纯度，8μL用于反转录。反转录体系为5×RT Master Mix 2μL，RNA 溶解液 8μL，反转录总体积 10μL。反转录的条件为37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃5 min，反转录产物4℃保存。

1.6.3 实时荧光PCR反应 将反转录产物10倍稀释后作为PCR反应模板，PCR的反应体系为:1μL稀释液，上下游引物 10μmol/L(表 1)各1μL，2×SYBR Green I 12.5μL，添加高压灭菌的三蒸水至终体积25μL，混匀。反应条件:起始95℃ 5 min，扩增时95℃ 15 s，60℃15 s，72℃45 s循环40次，溶解曲线分析。以GADPH为内参，进行PCR扩增产物的实时定量分析。

实时定量PCR数据采用比较阈值法进行相对定量分析。计算方法:目的基因诱导或抑制倍数=2－ΔΔCt，Ct值是热循环仪中荧光达到阈值循环数，ΔΔCt=实验组ΔCt(目的基因Ct－内参基因Ct)－对照组ΔCt(目的基因Ct－内参基因Ct)。计算每一个标本目的基因的拷贝数。

表1 实时荧光PCR引物Tab.1 Sequence of primer used in real-time PCR

1.7 数据统计学分析 所有试验数据用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，数据均用“”表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞增殖的影响MTT实验结果表明，随着齐墩果酸和绿原酸质量浓度的增大，对HepG2细胞抑制率明显升高，并且具有明显的剂量依赖关系。质量浓度低于50μg/mL时，绿原酸对HepG2细胞的抑制作用比齐墩果酸强，但质量浓度高于50μg/mL，齐墩果酸对HepG2的抑制作用明显高于绿原酸。在50μg/mL时，两种药物的抑制率相同。利福平6.25～200μg/mL对HepG2细胞的抑制作用都在40%左右，抑制作用较强。在下述细胞周期和实时荧光定量PCR实验中选择药物处理质量浓度为100、50和25μg/mL，阳性对照利福平10μg/mL。观察齐墩果酸、绿原酸和利福平对HepG2细胞周期和CYP1A1 mRNA、CYP3A4 mRNA表达的影响。见图1。

图1 齐墩果酸、绿原酸和利福平对HepG2细胞增殖的影响Fig.1 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and rifampicin on proliferation of HepG2 cells

2.2 流式细胞术测定3种质量浓度齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞周期的影响 经3种药物不同质量浓度药物处理后，HepG2细胞各时期细胞数占细胞总数的百分比与正常对照组相比较，有些细胞周期分布发生了明显变化。齐墩果酸25μg/mL和绿原酸 50、25μg/mL、阳性对照利福平 10μg/mL均对细胞周期没有明显影响。齐墩果酸的100、50μg/mL 和绿原酸的100μg/mL 均对HepG2细胞周期S期发生了明显阻滞。见图2。

图2 不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸对HepG2细胞周期的影响Fig.2 Different concentrations of oleanlic acid and chlorogenic on the cell cycle of HepG2 cells

2.3 实时荧光PCR检测两种药物不同质量浓度对HepG2细胞中CYP1A1 mRNA表达的影响 实验结果显示，齐墩果酸在3个质量浓度均可明显诱导HepG2细胞中CYP1A1 mRNA表达，给药质量浓度从大到小诱导倍数依次为2.48、1.45、2.34。绿原酸3个质量浓度均可明显抑制HepG2细胞中CYP1A1 mRNA表达，给药质量浓度从大到小抑制倍数依次为1.91、0.61、2.82，阳性对照利福平10μg/mL的诱导倍数为2.3相对较弱。见图3。

图3 齐墩果酸、绿原酸和利福平对HepG2细胞CYP1A1 mRNA表达的影响Fig.3 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and rifampicin on the expression of in CYP1A1 mRNA HepG2 cells

2.4 实时荧光PCR检测两种药物不同质量浓度对HepG2细胞中CYP3A4 mRNA表达的影响 实验结果显示，齐墩果酸在3个质量浓度均可明显诱导HepG2细胞中CYP3A4 mRNA表达，给药质量浓度从大到小诱导倍数依次为1.17、2.42、8.40。绿原酸 100、50μg/mL均可抑制 HepG2细胞中CYP3A4 mRNA表达，抑制倍数依次为 0.65、1.00，绿原酸 25μg/mL HepG2细胞中 CYP3A4 mRNA表达可明显诱导HepG2细胞中CYP3A4 mRNA表达，诱导倍数为0.59，诱导相对较弱，阳性对照利福平10μg/mL能显著诱导HepG2细胞中CYP3A4 mRNA表达，诱导能力较强。见图4。

3 讨论

药物代谢酶在药物的代谢解毒和代谢活化中起着重要的作用［9］。研究中药成分对 CYP的影响，为预测有关中西药之间相互作用，提高中药有效成分的有效性和安全性具有重要意义。

图4 齐墩果酸、绿原酸和利福平对HepG2细胞CYP3A4 mRNA表达的影响Fig.4 Effect of oleanolic acid and chlorogenic acid and rifampicin on theexpression ofin CYP3A4 mRNA cells HepG2

齐墩果酸和绿原酸是一种天然药物，国内对其提取分离及药理作用研究较多，但很多作用机制尚处于研究探索阶段［10］。因此，进一步研究两种药物抗肿瘤机理及其药物的体外代谢，显得很有意义。HepG2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征，最大的优点是保留了一系列生物转化过程中的Ⅰ相和Ⅱ相酶，是研究和评价防治肝癌药物的较理想细胞模型。

MTT实验结果表明，200～6.25μg/mL齐墩果酸和绿原酸均可抑制肝癌细胞 HepG2生长，50μg/mL时，两种药物的抑制率相同，说明齐墩果酸和绿原酸是潜在防治肝癌的中药制剂，利福平在一定范围能显著抑制肝癌细胞生长。细胞周期在肿瘤的生长调控中具有重要的作用，通过改变细胞周期来阻止肿瘤细胞的无限增殖已受到人们的关注［11］。细胞周期的调节主要发生在2个重要阶段:G1-S期和G2-M期。齐墩果酸和绿原酸的有效质量浓度处理HepG2细胞，使S期细胞显著降低，两种药物有可能通过影响细胞周期而抑制细胞生长。

近年来认为CYP1A1活化苯并芘等多种多环芳烃化合物使其致癌［12］，并且CYP1A1的诱导能力是作为评价致癌性的重要指标。本研究发现，齐墩果酸和绿原酸的三个有效质量浓度均能诱导的CYP1A1 mRNA表达，由于齐墩果酸和绿原酸对CYP1A1的诱导是否可能增加机体对毒性物质代谢发生变化，对机体造成一定的损害，长期服用含齐墩果酸和绿原酸的药物是否对机体有潜在的毒副作用，对药物代谢性相互作用的影响，有待于进一步实验研究。

CYP3A4可同时氧化代谢多种药物，导致药效的增强(降低)或毒副作用的增加［13］。由于其代谢的广泛性，进一步影响了药物的药效学和毒理学。本实验结果显示，齐墩果酸高、中、低3个质量浓度是CYP3A4的诱导剂，而绿原酸的低质量浓度是CYP3A4的抑制剂，两种药物与其他药物合用时，能够影响其他药物的血药浓度和生物利用度，对药物相互性作用的影响有待于进一步研究，利福平是肝癌细胞的强诱导剂。有相关文献报道［4-15］，齐墩果酸能抑制肝癌细胞SMC-7721、Hep3B的增殖和诱导其凋亡。

综上所述，本实验分析了齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞周期和两种CYP450酶的诱导作用。本实验结果初步证明齐墩果酸和绿原酸对CYP450酶系的诱导作用，实验结果为中西药代谢相关性提供了体外实验的数据支持。两种药物体内是否也存在CYP450酶的诱导或者抑制作用，有待于进一步的实验研究。

［1］刘高峰，郭兴蕾.中药对细胞色素P450调控作用的研究进展［J］.中草药，2008，39(1):139-143.

［2］钟育敏，吴文康.中药对细胞色素P450调控作用的研究进展［J］.陕西中医，2011，32(2):244-247.

［3］张明发，沈雅琴.齐墩果酸和熊果酸保肝药理作用的研究进展［J］.抗感染药学，2012，9(1):13-19.

［4］汤新慧，严丽芳，徐力致，等.3种五环三萜化合物对高钙诱发的小鼠肝MPT的抑制作用研究［J］.中国中药杂志，2011，36(4):496-499.

［5］陈 莉，尚 娟，王志凤，等.硝酸酯/齐墩果酸杂合物的合成及HepG2细胞凋亡抑制活性的研究［J］.药学学报，2010，45(12):1516-1522.

［6］戚晓渊，史秀灵，高银辉，等.绿原酸抗肝纤维化作用的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(15):139-143.

［7］史秀玲，高银辉.绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(19):199-202.

［8］Neimi M，Backman J T，Fromm M F，et al.Pharmacokinetic interactions with rifampicin:clinical relevance［J］.Clin Pharmacokinet，2003，42(9):819-850.

［9］Glei M ，Kirmse A，Haberman N.Bread enriched with green coffee extract has chemoprotectire and antigenotoxic antivities in human cells［J］.Nutr Canner，2006，56(4):192.

［10］王 奇，芦柏震.齐墩果酸的研究进展［J］.中国药房，2008，19(9):711-712.

［11］Townsend D M，Tew K D.The role of glutathione-S-transferase in anti-canner drug resistance［J］.Oncogene，2003 ，22(47):7369-7375.

［12］Shaik A P，Jamil K，Das P.CYP1A1 polymorphisms and risk of prostate cancer:a meta-analysis［J］.Urol J，2009，6(2);78-86.

［13］Klein K，Thomas M，Winter S，et al.PPARA:a novel genetic determinant of CYP3A4 in vitro and in vivo［J］.Clin Pharmacol Ther，2012，91(6):1044-1052.

［14］黄开顺，朱链链，刘 丹，等.齐墩果酸抑制肝癌细胞QGY增殖和诱导凋亡的作用研究［J］.世界科技研究与发展，2011，33(2):318-321.

［15］吴英俊，王超男，刘洁婷，等.蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用［J］.中国生化药物杂志，2011，32(4):306-308.