窄谱中波紫外线对银屑病Th17/Treg表达的影响

陈晋广 ，赖维 ，姜昱

（1.广东省中山市人民医院，中山528403；2.浙江省台州市立医院，台州318000；3.中山大学附属第三医院，广州510630）

银屑病是皮肤科常见的复发性炎症性自身免疫性皮肤病，目前大量研究提示，CD4+T细胞即T辅助性细胞（helper T cells，Th）在银屑病的发病中起着重要作用。在不同的条件下，初始CD4+T淋巴细胞可分化成不同T淋巴细胞亚群，包括Th1/Th2型、辅助性 T细胞17（T helper 17 Cells,Th17）/调节性T细胞（regulatory T cell,Treg），发挥不同的生物学效应。其中，Th17、Treg亚群是近年来发现的Th细胞新亚群,在肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病中发挥重要作用，成为近年来研究的热点。笔者前期研究发现，寻常性银屑病Th17/Treg相关细胞因子IL-17、IL-23表达升高，NB-UVB光疗可有效降低患者外周血中IL-17、IL-23的表达[1]。窄谱中波紫外线（narrow-band ultraviolet B，NB-UVB）治疗银屑病临床疗效较好，但其作用机制仍未完全明了。本研究以Th17、Treg为观察指标，分别对银屑病患者接受NB-UVB光疗前、后Th17/Treg变化情况进行检测，探讨NB-UVB治疗银屑病的免疫学机制。

1 资料与方法

1.1 病例资料 61例寻常性银屑病患者均来自2012年4月—2013年4月本院皮肤科门诊和住院患者。其中男32例,女29例；年龄19～48岁，平均（29.0±3.5）岁；病程3～10年。50例本院门诊的健康体检人员作为正常对照组，其中男26例，女24例；年龄 20～50岁，平均（30.0±2.5）岁。2组研究对象在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有研究对象对实验知情同意并签署知情同意书，实验经医学伦理委员会批准。

1.2 排除标准 患者近1个月内接受过系统性抗银屑病治疗或半个月内局部应用相关药物治疗者；妊娠期、哺乳期患者；伴有其他严重性系统性疾病或皮肤疾病；有紫外线照射禁忌证人群。

1.3 光疗方法 使用窄谱中波紫外线光疗仪（德国沃曼公司，波长为310～315 nm、峰值311 nm）进行治疗。首次光疗剂量为70%的最小红斑量（minimal erythema doses，MED），隔日 1次；后续光疗剂量在前次剂量基础上按局部皮肤反应依次递增10%～20%，至光疗区皮肤出现淡红斑时则维持该剂量进行治疗。治疗过程中若出现疼痛性红斑或水泡时应停止光照，至皮损恢复后再继续照射，剂量为前次剂量的50%。20次为1个疗程。

1.4 PASI评定 分别于光疗前、光疗10次及光疗20次后计算PASI积分，病情改善率（%）=[(治疗前PASI评分-治疗后PASI评分)∕治疗前PASI评分]×100%。临床疗效分为治愈（病情改善率≥90%）、显效（病情改善率在60%～89%）、好转（病情改善率在25%～59%）和无效（病情改善率＜25%）4个等级。有效率=[（治愈+显效）/总治疗人数]×100%。

1.5 Th17和CD4+CD25+Treg亚群检测 所有研究对象分别抽取治疗前后清晨空腹外周静脉血约5 mL，肝素抗凝淋巴细胞分离液以Ficoll密度梯度法分离出外周血淋巴细胞,1%小牛血清PBS冲洗,制备淋巴细胞悬液（浓度1×109/L）。取淋巴细胞悬液置于48孔培养板内,每孔1 mL，加50 μg/L佛波酯、1 mg/L离子霉素和莫能菌素2 μmol/L，孵箱（德国HERAEUS 公司，37 ℃、5%CO2）中培养 5 h。收集细胞分为实验管和对照管,加入20 μL PE-Cy5标记的鼠抗人CD4单抗（美国e Bioscience公司）混匀，放置20 min（室温、避光），对细胞表面抗原进行染色。加200 μL Cytofix/Cytoperm液,在4℃下放置20 min，通透和固定细胞，洗涤。实验管分别加入10 μL FITC标记的鼠抗人CD25抗体（美国e Bioscience公司）、FITC标记的IL-17抗体（美国e Bioscience公司），对照管加入同型对照抗体，孵育30 min后（4℃、避光），用Perm/Wash液1 mL洗涤2次，以300 μL洗涤液重悬细胞，采用流式细胞仪（EPICS-XL COULTER）于24 h内检测分析。以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4＋），最终以散点图IL-17、CD25染色阳性分别表示Th17细胞和Treg细胞，数据用Cellsquest软件分析。

1.6 统计学分析 本研究采用SPSS 12.0软件进行分析，2组比较采用t检验，用Spearman秩相关系数进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光疗前后PASI积分比较 患者光疗10次（15.21±1.11）与 20 次后的 PASI（10.21±1.10）比较，差异有统计学意义（P<0.05）；光疗10次后PASI评分与光疗前（25.31±6.93）相比，患者的PSAI积分显著降低，症状明显改善，差异有统计学意义（P＜0.01）。其中治愈10例，显效38例，好转13例，无效0例，有效率为78.7%。

2.2 光疗前后Th17/Treg比较 光疗前银屑病患者Th17细胞表达明显高于对照组（P<0.05），Treg细胞表达与正常组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；患者Th17/Treg表达高于对照组（P＜0.05），且与PASI评分呈正相关（r＝0.490，P＜0.05）。患者光疗 10次、光疗20次后的Th17细胞表达、Th17/Treg均呈显著下降（P＜0.05），但仍高于对照组（P＜0.05）；患者Treg细胞表达在各个治疗阶段均无明显改变（P＞0.05）。详见表 1。

表1 光疗前、后不同阶段Th17/Treg比较

3 讨论

Th17细胞是近期发现的有别于传统Th1/Th2细胞分化途径CD4+T新亚型，以分泌IL-17为主要特征。Treg细胞在分化途径和功能上则与Th17相对抗，对机体部分效应性及自身反应性T细胞具有选择性抑制作用；两者在正常生理状态下保持动态平衡，维持免疫稳定。近年来随着对Th17/Treg研究的深入，使人们对多种自身免疫性疾病发病机制有了新的认识。Th17细胞在促炎反应和中性粒细胞的动员、募集以及活化反应中起到重要的作用；有研究发现，Th17细胞及相关的细胞因子可能是银屑病发病的重要病理基础[2]。在银屑病TGF-β1转基因小鼠模型实验中发现，IL-23/Th17途径细胞因子水平增高，CD4+CD25+Treg细胞功能受损[3]。众多研究提示，Th17/Treg参与了银屑病的发病过程。

NB-UVB治疗银屑病安全性好、不良反应少、应用方便，在临床治疗中得到医生和患者的一致青睐。笔者采用NB-UVB治疗银屑病临床研究显示,NB-UVB治疗寻常性银屑病有效率达78.7%，疗效较好；治疗中未出现严重的不良反应，患者依从性好。实验研究还发现，银屑病患者Th17、Th17/Treg均明显高于正常对照组（P<0.05），Treg与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；Th17/Treg表达与患者 PASI评分呈正相关性（r＝0.490，P＜0.05）。Zhang等[4]研究发现，银屑病机体循环中的Th17/Treg比值与患者PASI积分呈正相关，与本结果一致。光疗10次和光疗20次后，患者PASI积分均得到不同程度的降低，提示NB-UVB可通过调节银屑病患者外周血中Th17/Treg的失衡来发挥作用。近年来国外学者开展了许多针对Th17/Treg干预的实验研究[5]，如抗肿瘤坏死因子拮抗剂依那西普，可通过逆转Th1/Th17细胞的活化上调Th2、Treg亚群，达到治疗银屑病的作用。因此，基于Th17/Treg失衡的研究，不仅解释或完善银屑病部分发病机制，而且可能为银屑病临床治疗提供新方向。

[1] 陈晋广,赖维,姜昱，等.窄谱中波紫外线对银屑病的疗效及外周血IL-17和IL-23的影响 [J].中华物理医学与康复杂志,2013，35（3）:218-219.

[2] Di Cesare A，Meglio PD，Nestle FO.The IL-23/Th17 axis in the immunopathogenesis of psoriasis[J].J Invest Dermatol，2009，129:1339-1350.

[3] Sch觟n MP.Animal models of psoriasis:a critical appraisal[J].Exp Dermatol,2008,17:703-712.

[4] Zhang L,Yang XQ,Cheng J,et al.Increased Th17 cells are accompanied by FoxP3 (+)Treg cell accumulation and correlated with psoriasis disease severity[J].Clin Immunol,2010,135:108-117.

[5] Quaglino P,Bergallo M,Ponti R,et al.Th1,th2,th17 and regulatory T cell pattern in psoriatic patients:modulation of cytokines and gene targets induced by etanercept treatment and correlation with clinical response[J].Dermatology,2011,223:57-67.