葛花粉体高效球磨制备技术及其醒酒活性测定*

许阳，杜先锋，王一见

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥，230036)

葛花是古方解酒良药［1］，其主要化学成分有黄酮类、三萜皂苷类、香豆素类、甾醇类、挥发油、生物碱和人体不能合成的必需氨基酸和无机盐。日本学者金城顺英指出，葛花中含有的皂角苷和异黄酮可以改善酒精对人体造成的新陈代谢异常［2］，从而起到解酒醒酒的作用。而葛花含有18 种异黄酮类化合物［3］，目前国内研究均注重于其中功能成分的提取和分离，但随着目前饮酒、酗酒群体日益激增，对高效迅速的醒酒措施需求加大，而采用传统煎煮的用药方式可能会导致药液中物质发生络合、水解、氧化等反应，使功效减弱，以单一某种功能成分为目标进行提取优化则会导致其他有效组分的大量丢失，且增加成本投入，不利于资源综合利用。本实验旨在探究采用高效球磨技术将葛花进行精细粉碎，进而增大表面电能及其与介质的接触面积，最大程度保留其中的功能因子，提高植物细胞中初级代谢产物和次级代谢产物的溶出速率和溶出量。

本文将采用高效球磨技术制备葛花粉体与传统粉碎方法制备的粉体进行比较，采用瓦勒-赫霍法并稍加改良后，通过体外测定ADH 活性［4］，考察葛花粉体对ADH 活性的影响。

1 材料与仪器

1.1 原辅材料

葛花，安徽省霍山县黄何葛业有限公司。

1.2 试剂

芦丁标准品，中国药品生物制品检定所;氧化型辅酶I(NAD+)，中国医药集团上海化学试剂公司;乙醇脱氢酶(ADH)，Sigma 公司;其他试剂均为分析纯。

1.3 实验装置

高效球磨机结构如图1 所示，罐体通过弹簧伸缩变化而进行快速多维摆动式运动，使物料在罐内不规则运动产生巨大的冲击力，延长物料的运动轨迹、提高冲击能、减少撞击盲点，显著提高罐内磨介的冲击能量和运动次数，提高了被粉碎颗粒的均匀度。与此同时，为避免罐体迅速升温而导致物料性状发生改变，采用罐体夹套循环水进行冷却降温。

图1 高效球磨机示意图Fig.1 Schematic diagram of high efficient ball mill

1.4 仪器

unicUV-2102C 型紫外分光光度计;PB-10 Sartorius 精密pH 计;Konica CM-3500d 台式色差仪;Mastersizer2000 激光粒度分析仪。

2 实验方法

2.1 植物样品的制备

将葛花洗净、晾干，60 ℃烘干2 h，置于干燥器内备用。

取一定量的葛花原料，用HX-200A 型高速中药粉碎机粉碎，取100 ～150 目筛之间为葛花的常规粉体。常规粉体再经超微粉碎后，取200 ～300 目筛之间粉体为Ⅰ级粉体。再取Ⅰ级粉体经高效球磨机得到Ⅱ级粉体。

2.2 激光粒度分布测试

以空气为分散介质，经Mastersizer2000 激光粒度分析仪进行粒径分析。

2.3 总溶出度的测定

精密称取葛花、常规粉体、Ⅰ级粉体、Ⅱ级粉体各5．000 0 g 于锥形瓶中，加入纯水150 mL，置于(37 ±1)℃水浴加热，分别于1、3、5、10、20、30、60 min 后过滤，取50 mL 滤液于已知恒重的铝制称量皿中，90℃水浴蒸干后擦去器皿外壁水分，放入(100 ±2)℃烘箱干燥1 h 后于室温冷却30 min，反复干燥冷却操作，保证最后2 次重量之差小于2 mg，准确称重(恒重)，以干燥后的恒重与称量皿自重的差值表示总物质溶出度。每组设3 次平行样，计算结果取平均值。

2.4 芦丁标准曲线的制备

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 衍生体系方法［8］。

准确称取105 ℃干燥至质量恒定的芦丁标准品20 mg，用80%乙醇溶解，配制成0．2 mg/mL 的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分别置于10 mL 比色管中，用80%乙醇补至5.0 mL，加入0.3 mL5%NaNO2溶液，摇匀，静置5 min 后加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液摇匀，静置6 min 后再加入4.0 mL 4%NaOH 溶液，摇匀后纯水定容至刻度线，混合均匀，于80 ℃水浴静置10 min，冷却至室温后于506 nm 测定吸光度。回归方程为Y=7.02X﹣0.019 8(X为芦丁标品在506 nm 下的OD值)，R2=0.999 1。

2.5 总黄酮溶出量的测定

精密称取葛花、常规粉体、Ⅰ级粉体、Ⅱ级粉体各5.0 g 于锥形瓶中，加纯水150 mL 置于(37 ±1)℃水浴加热60 min 后，过滤，取滤液2.0 mL 置于10 mL比色管中，用80%乙醇补至5.0 mL 后，按2.4 所述方法依次加入反应试剂，以不加Al(NO3)3溶液为空白对照进行测定。以80%乙醇85 ℃水浴条件下回流浸提3 次测得的总黄酮溶出量为指标考察4 种不同方法处理得到的葛花粉体对其中总黄酮溶出量的影响。

式中:c，葛花溶液总黄酮浓度(mg/mL);V，待测提取液的体积(mL);m，葛花粉体质量(g)。

2.6 不同粉体溶液色度差的测定

溶液颜色的比较使用Konica CM-3500d 进行检测，并根据测定得出的数据(L*、a*、b*)对4 种不同粉体溶液色差进行分析比较。

2.7 乙醇脱氢酶(ADH)活力的测定

称取10.0 g 各级粉体于溶于150 mL 纯水中，于37 ℃水浴加热90 min，取滤液50 mL，采用瓦勒-赫霍法，并稍加改良测定ADH 活力。取pH = 8.8 的Na4P2O7溶液1.5 mL 于比色管中，加入27 mmol/L 辅酶溶液(NAD+)1.0 mL，11.5%乙醇溶液0.5 mL，样品溶液0.1 mL，混合后，于25 ℃水浴中加盖育温5 min 后立即加入ADH 溶液0.1 mL，混合摇匀后每隔10 s 立即测定λ =340 nm 时的吸光值，连续测定5 min。以纯水代替乙醇作为参比调零，以纯水代替样品溶液测定对照组ADH 酶活。

以A340对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340/10 s 的增加值，根据NADH 的摩尔吸光系数κ=6．2 ×103［L/(mol·cm)］计算ADH 酶活。公式如下:

3 结果与分析

3.1 葛花Ⅱ级粉体粒度分析

由于实际颗粒的形状通常为非球形的，难以直接用直径表示其大小，因此在颗粒粒度测试领域，对非球形颗粒，通常以等效粒径来表征颗粒的粒径。如图2 所示，激光粒度分析仪测得葛花Ⅱ级粉体粒度分布基本呈正态分布趋势，葛花粉体粒径范围在4.25 ～43.74 μm，中值粒径d(0.5)为8.08 μm，大多数高等植物细胞的直径通常约在10 ～200 μm，可见经过高效球磨技术处理的葛花粉末已基本达到细胞破碎的水平，更有利于其胞内有效物质的释放。

3.2 葛花粉体特性对比实验

3.2.1 总物质溶出度比较

图2 葛花Ⅱ级粉体粒径分布图Fig.2 Particle size distribution of second grade of Flos puerariae

不同粉碎级别粉体总溶出度的测定结果见表1。表1 结果表明，各粉体的溶出度随水浴加热时间增加而逐渐提高，其中葛花Ⅱ级粉体均在瞬时溶出度(1 min)及后续时间段高于其他组别，葛花Ⅱ级粉体(0.182 49 g)比未处理的植物本体(0.021 45 g)高出8.6 倍，葛花Ⅱ级粉体的溶出度在20 min 后其速率趋于平缓，但较其余组别仍一直保持较高溶出量。

3.2.2 总黄酮溶出量比较

功能性因子黄酮主要存在于植物体细胞中，由纤维素和果胶构成的坚韧细胞壁会阻碍黄酮的溶出，影响其利用度。由图3 可以看出，随着植物粉体粒径的不断减小，在同温同体积下浸提得到的黄酮，其溶出量存在明显变化，由未处理葛花本体的2.67 mg/g 升高至Ⅱ级粉体的9.75 mg/g，与80%乙醇提取3 次得到的黄酮溶出量12.21 mg/g 比较，Ⅱ级粉体黄酮溶出含量提高57.98%。可见采用高效球磨技术，对细胞进行破壁处理，可使绝大多数的功能性成分在短时间内充分溶解于介质当中，最大程度提高其生物利用度。

表1 葛花不同粒径粉体对总物质溶出度的影响Table 1 Effect of different particle sizes of Flos puerariae on total material dissolution

图3 葛花不同粒径粉体对总黄酮溶出量的影响Fig.3 Effect of different particle sizes of Flos puerariae on flavone dissolution

3.2.3 葛花不同粒径粉体溶液色度差的比较

L*是色彩的明度值，其范围从0 到100，值为0时亮度最低，为100 时亮度最高。a*、b*值是色彩的色度值，其中a*值从红(正值)到绿(负值)渐变，b*值则是由黄(正值)到蓝(负值)渐变。

由表2 可知虽然未处理葛花溶液的亮度最高，但是色度值均低于其他组，而由葛花Ⅱ级粉体制备的溶液色度值最高，溶液的颜色最深，但是亮度却比常规粉体和I 级粉体清亮。由3.2.1 及3.2.2 的实验结果可知葛花Ⅱ级粉体单位时间内的释放量及其功能因子的溶出度最好，以其溶液色度参数为标准值计算总色差，结果表明未处理的溶液颜色与标准样差别最大，其次是常规粉体，I 级粉体溶液与标准样最为接近，结合上述Ⅱ级粉体溶液较其他组别在总溶出度和黄酮溶出量上有明显差异的实验结果，在该色度差实验中通过a*、b*值的变化得到进一步补充说明，但L*值并不随趋势减小，较常规粉体和Ⅰ级粉体的溶液L*值反而变大，溶液更为清亮，这提示该结果可能与采用球磨机制得Ⅱ级粉体其独特的破壁结构和粒径特性有关。

3.3 乙醇脱氢酶(ADH)活力的测定

乙醇进入机体后，在细胞质内经乙醇脱氢酶(ADH)氧化成乙醛，此过程是乙醇代谢的第一关卡，会消耗大量的辅酶Ⅰ(NAD+)，长期过量饮酒或一次大量饮酒会导致ADH 活性降低［9］，根据产物DADH在340 nm 处有最大吸收，且这种变化速率与ADH 活力存在一定线性关系来计算葛花不同粒径粉体对ADH 活性的影响。

表2 不同溶液色度差的分析结果Table 2 Analysis results of colour aberrations on different solutions

测定结果见表3，比较植物经过不同粉碎处理后对ADH 活性的影响，发现Ⅱ级粉体均对ADH 激活率最高，其次是Ⅰ级粉体、常规粉体，对ADH 激活率最低的是不做任何处理的传统植物本身，说明通过高效球磨技术处理后的植物粉体能在短时间内快速促进其功效的发挥，迅速提高ADH 的活性。

表3 葛花不同粒径粉体对ADH 活性的影响Table 3 Effect of different particle sizes of Flos Puerariae on the activity of ADH

4 结论

通过比较葛花不同粒径粉体的系列实验结果可以发现，若采用传统直接煎煮方法获得功能成分和功效最不理想，而采用球磨技术制备的Ⅱ级粉体中值粒径为8.08 μm(根据目数与粒径的对应关系10 μm 对应目数为1 340 目，则8.08 μm 对应目数超过1 340目)，且粉体粉碎度均匀，也无完整的细胞结构，达到细胞级粉碎破壁水平，而且实验结果表明植物中总溶出度、黄酮溶出量的影响均与粉体粒径度有直接关系，粉体粒度越小，溶出时间越短。乙醇脱氢酶活性的变化影响到血中乙醇的浓度，若该酶的活力下降则导致机体中可利用的乙醇含量增加，进而加重乙醇对脑、肝脏等器官伤害作用。Yokoyama 指出ADH 在乙醇第一步的代谢中起到关键作用［11］，可以减少机体对乙醇的利用度，防止酒精性肝病的发生。上述实验结果表明，葛花Ⅱ级粉体对ADH 的激活率最高，是未处理葛花激活率的2 倍，采用此高效球磨技术得到的超微粉体可达到有效成分溶出速度快、功效释放迅速的目的。

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