Sulfolobus tokodaii strain 7 高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质*

魏涛，孙浩，申玉龙，毛多斌

1(郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州，450002)

2(山东大学微生物技术国家重点实验室，山东 济南，250100)

高温酸性α-淀粉酶是淀粉制糖工业中重要的酶制剂，有着非常广泛的应用前景。发展淀粉制糖工业也是解决当前淀粉生产积压的重要途径。淀粉水解包括液化和糖化2 个步骤，高温α-淀粉酶在液化过程中起关键作用，现在常用的高温α-淀粉酶其最适pH 范围为6 ～7，并且在酸性糖化条件下酶活力会明显降低，不能满足在酸性条件下淀粉原料液化的要求，因此开发一种高温酸性α-淀粉酶具有重要意义［1－4］。

极端超嗜热古菌Sulfolobus tokodaiistrain 7 于1983 年在日本九州岛的别府热泉中发现，是一种好养性异养微生物，能利用淀粉等多种多糖营养物，最适生长条件为80 ℃，pH 2.5 ～3，分类上属泉古菌［5］。基因组测序结果和序列分析表明，在S.tokodaiistrain 7 基因组中存在多个淀粉酶基因［6］。本文将S.tokodaiistrain 7 中α-淀粉酶基因ST0817 在大肠杆菌中克隆表达，并详细研究了酶学性质，为对该酶进行定向进化以及高温酸性α-淀粉酶工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

嗜热古菌S.tokodaiistrain 7 购自JCM (Japan Collection of Microorganisms);大肠杆菌Escherichia coliDH5a 与E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL 为本实验室保存。克隆与表达质粒pET15b 购自Novagen公司。

1.2 工具酶与试剂

限制性内切酶、DNA 连接试剂盒、ProbestTMDNA聚合酶，TaKaRa 公司产品;PCR 引物，由上海生工公司合成;质粒提取和琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京天根生物科技有限公司;直连淀粉、可溶性淀粉、支链淀粉、β-极限糊精、糖原、环糊精和普鲁兰糖，购自Sigma 公司。

1.3 高温酸性α-淀粉酶基因克隆

根据S.tokodaiistrain 7 高温酸性α-淀粉酶基因(ST0817)设计引物:上游:下游:5'- GCCCTCA TTT CAG CCA CTC TTTT AAAT ATTTTTC -3'，划线部分分别为上游引物的NdeⅠ酶切位点与下游引物的SalⅠ酶切位点。100 μL PCR反应体系:模板0.5 μL(25 ng)，dNTP (25 mmol/l)0.5 μL，引物(100 μmol/L)各0.5 μL，10 ×缓冲液10 μL，ProbestTMDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，超纯水87.5 μL。PCR 反应条件:94℃5 min;94℃30s，55℃30s，72℃1 min，30 个循环。PCR 产物回收经NdeⅠ和SalⅠ酶切后连接到经同样酶切的pET15b 上，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，经双酶切NdeⅠ和SalⅠ及上海生工测序验证后将其命名为pET15b-ST0817。

1.4 蛋白的表达与纯化

将测序正确的重组质粒pET15b-ST0817 转入大肠杆菌E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL 中。带有重组质粒的表达菌在20 mL 含100 mg/L 氨苄青霉素和34 mg/L 氯霉素的LB 液体培养基中过夜培养，然后按1∶100 的体积比接到1 000 mL LB 液体培养基中继续培养至OD600nm为0.5，加入终浓度0.2 mmol/L IPTG 于37℃继续培养4h，4℃8 000 r/min 离心10 min。收集菌体悬浮破壁buffer(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl)中，超声波破碎菌体(功率300W，超声时间5s，间隔时间5s，超声次数150 次)。破壁后的菌液于75℃热处理30 min，用10 000 g 离心10 min，去除不耐热的蛋白沉淀，得到粗酶液。将粗酶过Ni-NTA 琼脂糖亲和层析得到纯化的酶蛋白。将过镍柱后的蛋白在50 mmol/L Tris/HCl (pH 8.0)缓冲液中透析，然后继续过Superdex-200 (16/60)分子筛柱。利用50 mmol/L Tris/HCl，50 mmol/L NaCl(pH 8)的缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.5 mL/min，收集体积为0.5 mL。将纯化后的酶蛋白液用离心过滤器(10 kDa，Millipore)进行浓缩，然后加入等体积的50%(V/V)的甘油，于－20℃保存。蛋白质浓度用考马斯亮蓝比色Bradford 方法测定［7］。

1.5 高温α-淀粉酶的活性检测

高温α-淀粉酶活性测定参照文献［8］。酶活定义:1 g 固体酶粉(或1mL 液体酶)，于70℃、pH 6.0条件下，1 h 液化1 g 可溶性淀粉，即为1 个酶活力单位。

1.6 高温α-淀粉酶反应最适温度和最适pH

酶最适反应温度:在50 ～80 ℃，每隔5℃测定1次酶活力，最大的活性定义为100%。

酶最适反应pH:分别使用柠檬酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液、磷酸缓冲液和Tris-HCl 缓冲液体系配制pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的系列缓冲液，以最适反应pH 下所得酶活力定义为100%。

1.7 高温α-淀粉酶的热稳定性、pH 稳定性及耐酸性

酶的热稳定性:将适量的酶加入到500 μL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 5.8)缓冲液中，分别在75、85、95℃处理2、4、6 和8 h 后取出样品，用标准测定方法测定残余的酶活力。未处理前的酶活力定义为100%。

酶的pH 稳定性:将适量的酶加入各种缓冲液中:在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 中分别处理60 min，然后再分别在对应的pH 检测酶活，以处理前的酶活性为100%。

酶的耐酸性:将适量的酶加入50 mmol/L 乙酸钠缓冲液，pH 5.5、5.2 和5.0 处理30、60、90 和120 min后取出样品，用标准测定方法测定残余的酶活力。未处理前的酶活力定义为100%。

1.8 高温α-淀粉酶底物特异性

对以下底物进行底物特异性检测［9］:直链淀粉、可溶性淀粉、支链淀粉、β-极限糊精、糖原、环糊精和普鲁兰糖(浓度均为1 mg/mL)。

1.9 高温α-淀粉酶对变性剂抗性的研究

为研究各种变性剂对酶活性的影响，适量酶蛋白在于各种试剂中于室温下处理30 min，然后用标准酶活检测方法测定残余的酶活力。各种添加剂或变性剂为:重金属盐离子Mg2+，Mn2+，Co2+，Ca2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+(分别为5 mmol/L);金属螯合剂EDTA(5 mmol/L);还原剂DTT(5 mmol/L);变性剂SDS(5%，W/V)、尿 素(4，8 mol/L)、Tween20、Tween80 和Trtion-X100(1%，5%，W/V);有机溶剂(50%，90%，W/V):乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、甲苯、氯仿和DMSO;丝氨酸变性剂PMSF(5 mmol/L)。

2 结果与分析

2.1 高温α-淀粉酶基因的扩增和表达质粒pET15b-ST0817 的构建

以S.tokodaiistrain 7 全基因组DNA 序列为模板，PCR 扩增得到与预期大小相符的目的片段(1 332bp)。构建的重组质粒pET15b-ST0817 经双酶切分析和DNA 测序验证。结果表明，克隆的高温酸性α-淀粉酶基因ST0817 与预期产物一致，表明重组质粒构建正确。

2.2 重组蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET15b-ST0817 转化大肠杆菌E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL 中，经0.2 mmol/L IPTG 诱导表达目的蛋白，经超声破壁、70℃热处理、镍柱亲核层析和分子筛纯化，得到纯化高温α-淀粉酶，分子质量是53.0 kDa，如图1 所示。

图1 α-淀粉酶的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE of the recombinant α-amylase

2.3 最适反应温度及热稳定性

酶最适反应温度为75℃，表明该酶为耐高温α-淀粉酶(如图2)。热稳定性实验表明，在85℃处理8 h，仍然保持50%左右的酶活力;75℃处理8 h，酶活力稳定在90%以上(如图3)。

图2 最适反应温度Fig.2 Optimal temperature of the recombinant α-amylase

图3 热稳定性Fig.3 Thermostability of the recombinant α-amylase

2.4 最适pH、pH 稳定性及耐酸性

该酶最适pH 为5.5，pH 4.5 ～7.5 处理60 min酶活力能保持最大活力的50%以上(如图4 所示)。在pH 5.2 处理120 min，仍然保持50%左右的酶活力(如图5 所示)。该酶的最适pH、pH 稳定性及耐酸性相关实验结果表明该酶是酸性α-淀粉酶。

图4 最适反应pH 和pH 稳定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of the recombinant α-amylase

图5 耐酸性Fig.5 The acid tolerance of the recombinant α-amylase

2.5 α-淀粉酶底物特异性

α-淀粉酶对各种底物的催化活性如表1 所示。可以看出，该酶专一性水解直链淀粉和可溶性淀粉中的α-1，4 糖苷键，对这2 种底物的水解活性最高，对支链淀粉和β-极限糊精活性次之，糖原、环糊精和普鲁兰糖水解活性较小。

表1 重组α-淀粉酶的底物特异性Table 1 The substrate specificity of the recombinant α-amylase

2.6 金属离子和抑制剂对α-淀粉酶的作用

如表2 所示，重金属离子Mg2+，Mn2+，Co2+，Ca2+，Ni2+(为5 mmol/L)对该α-淀粉酶活性没有影响，金属螯合剂EDTA 对活力也没有影响，说明该α-淀粉酶不是金属离子依赖性酶。然而，Cu2+，Zn2+，Fe2+明显的抑制酶的活力，分别使酶活下降了55%、45%，32%左右。在5 mmol/L 还原剂DTT 作用下，该酶保持98%活性;丝氨酸变性剂PMSF(50 mmol/L)能使酶活力完全丧失(为起始酶活的1%)，说明丝氨酸残基在酶的催化过程中起重要作用。

表2 金属离子和抑制剂对重组α-淀粉酶的作用Table 2 Effect of various metals and inhibitors on the activity of the recombinant α-amylase

2.7 有机溶剂和变性剂对α-淀粉酶的作用

有机溶剂和变性剂对α-淀粉酶的作用情况见表3。

该酶在有机溶剂(50%，90%，W/V)乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、甲苯、氯仿和DMSO 中保持起始酶活的80%以上，表明该酶具有较好的有机溶剂抗性;变性剂Tween20、Tween80 和Trtion-X100(5%，W/V)对酶活具有明显的抑制作用，分别使酶活下降了20%、45%，48%左右;酶在变性剂SDS(5%，W/V)、尿素(4、8 mol/L)中活性稳定(保持起始酶活的88%以上)。

表3 有机溶剂和变性剂对重组α-淀粉酶的作用Table 3 Effect of organic solvents and detergents on the activity of the recombinant α-amylase

续表3

3 结论

本文将来自超嗜热古菌S.tokodaiistrain 7 预测的α-淀粉酶(ST0817)基因在大肠杆菌中克隆表达，IPTG 诱导表达，经超声波破壁，热处理，Ni-NTA 柱亲和层析和分子筛层析纯化后，得到纯化的α-淀粉酶。酶学性质研究表明，该酶的最适温度与最适pH 分别为75℃与pH 5.5，表明该酶是高温酸性α-淀粉酶。同时该酶具有明显的热稳定性，在85℃时的半衰期为8h。该酶对不同底物水解活性不同，直链淀粉＞可溶性淀粉＞支链淀粉＞β-极限糊精＞糖原＞环糊精＞普鲁兰糖。该酶对有机溶剂(乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、甲苯、氯仿和DMSO)、变性剂(SDS)、尿素和重金属离子(Mg2+、Mn2+、Co2+、Ca2+和Ni2+)等具有抵抗作用。金属离子Ca2+和EDTA 对该酶的活性没有影响，表明α-淀粉酶活性不依赖金属离子，在液化和淀粉糖工艺中也无需添加金属离子，可以简化生产工艺，降低生产成本。由于该高温酸性α-淀粉酶天然具有较强的pH 稳定性，并且在酸性环境中具有较高的耐酸性，因此具有重要的潜在工业应用前景。

［1］ 张丽萍，徐岩，金建中. 酸性α-淀粉酶的研究与应用［J］． 酿酒，2002，29(3):19 －21.

［2］ 赵荧，刘红岩，宫正宇，等. 地衣芽孢杆菌A.4041 耐高温α-淀粉酶的纯化及性质［J］． 吉林大学自然科学学报，1997，3(3):85 －88.

［3］ Crab W，Mitchinson C. Enzymes involved in the precessing of starch to sugars［J］． Trends Biotechnol，1997，15(9):349 －352.

［4］ 王希菊，蒋宇，邵蔚蓝. 海栖热胞菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达［J］． 微生物通报，2005，32(4):25－30.

［5］ Suzuki T，Iwasaki T，Uzawa T，et al.Sulfolobus tokodaiisp. nov. (f.Sulfolobussp. strain 7)，a new member of the gennusSulfolobusisolated from Beppu Hot Springs，Japan［J］． Extremophiles，2002，6(1):39 －44.

［6］ Kawarabayasi Y，Hino Y，Horikawa H，et al. Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon，Sulfolobus tokodaiistrain 7［J］． DNA Res，2001，8 (4):123 －140.

［7］ Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microfram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］． Anal biochem，1976，72(5):248 －254.

［8］ 沈微，王正祥，唐雪明，等. 古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达［J］． 中国酿造，2003，124(1):12 －14.

［9］ Lee H S，Shockley K R，Schut G J，et al. Transcriptional and biochemical analysis of starch metabolism in the hyperthermophilic archaeonPyrococcus furiosus［J］． J Bacteriol，2006，188 (6):2 115 －2 125.