化学交联与酶法交联对鱼糜-明胶复合膜性质的影响*

陶忠，郑惠彬，翁武银

(集美大学生物工程学院，福建 厦门，361021)

近年来，利用多糖、蛋白质和脂类等天然高分子制备可降解/可食性包装材料已成为国内外研究的热点，其中蛋白质因具有良好的成膜性能和较高的营养价值而备受关注。另一方面，我国水产品年加工量已经超过1 600 万t［1］，在鱼糜生产和冻鱼片加工中必然会产生大量鱼皮、碎肉等下脚料。目前，这些下脚料主要是用于生产鱼粉等低值产品，有些甚至直接被丢弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

研究表明，鱼肉蛋白和鱼皮明胶都可以制备蛋白可食膜［2－3］，但蛋白质中大量的亲水性氨基酸会导致形成的可食膜的耐水性能较差。利用化学交联剂和酶交联剂不仅可以改善蛋白膜的机械性能，还可以提高膜的耐水性能［4－5］。其中，戊二醛由于价格低廉、交联效率高，作为化学交联剂已被应用于明胶蛋白膜［3，6］、乳清分离蛋白膜［7］和大豆蛋白膜［8］的性质改良。另一方面，相对于戊二醛的安全问题，酶交联剂在食品中的应用没有受到严格控制。谷氨酰胺转胺酶(TGase)作为常用的酶交联剂可以提高大豆蛋白膜［5，9］、明胶蛋白膜［10］的机械性能和耐水性能。而且，随着微生物发酵法生产TGase 的技术不断成熟，利用TGase 改良可食膜的生产成本也逐渐下降［7］。然而有关利用戊二醛或TGase 改良鱼糜-明胶复合膜的性质目前鲜见报道。

因此，本研究利用戊二醛和TGase 对鱼糜-明胶复合膜进行性质改良，比较化学交联与酶法交联对复合膜性质的影响，旨在为利用交联剂改良蛋白膜的性能提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻鲢鱼鱼糜(A 级，蛋白含量为16.8%，水分含量为78.1%)，福建安井食品有限公司;新鲜的白鲢鱼鱼皮，厦门同安源水水产食品有限公司;戊二醛溶液(AR)，国药集团化学试剂有限公司;TGase(酶活力100 ～120 U/g，食品级)，南宁庞博生物工程有限公司;DC 蛋白测定试剂盒，美国Bio-Rad 公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

Avanti J-25 高速冷冻离心机，美国Beckman 公司;FA25 高剪切分散乳化机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司;SPX 智能型恒温恒湿箱，宁波莱福科技有限公司;厚度仪，日本Ozaki MFG 公司;TMS-PRO质构仪，美国Food Technology 公司;UV-2600A 型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司;WSC-S 测色色差计，上海精密科学仪器有限公司;UM113 型搅拌脱泡机，日本Unix 有限公司;FT/IR-480 型傅里叶变换红外光谱仪，日本JASCO 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白膜的制备

白鲢鱼鱼皮利用0.05 mol/L NaOH 在10 ℃下浸泡16 h，清水漂洗，利用0.05 mol/L HCl 在室温下浸泡2 h 后，用蒸馏水漂洗至中性。经过酸碱处理的鱼皮利用80 ℃热水浸提1 h 后，迅速冷却至室温，通过离心(15 000 ×g，25 ℃，20 min)分离获得上清液，调制成蛋白浓度为2%的明胶蛋白溶液。将4 ℃下解冻的鱼糜在冰浴条件下搅拌30 min，利用高剪切分散乳化机(16 000 r/min)均质90 s，调制成蛋白浓度为2%的鱼糜蛋白溶液。将明胶蛋白溶液和鱼糜蛋白溶液按照1∶1 混合均匀后，调pH 至8.0，添加蛋白质量20%的甘油制备成膜液。为了研究交联剂对复合膜性质的影响，膜液中分别添加了蛋白质量0.025% ～0.2%的戊二醛或0.5% ～2.5%的TGase，然后利用搅拌脱泡机进行脱泡。将脱泡后的成膜液(4 g)倒在5 cm× 5 cm 的有机硅树脂框内，先在温度25 ℃下干燥15 h，接着在45 ℃下干燥1 h，最后冷却至室温进行揭膜。将获得的蛋白膜放在25 ℃，相对湿度50%的恒温恒湿箱中平衡24 h 后，作为以下实验的测试样品。

1.3.2 机械性能的测定

蛋白膜的机械性能按照参考文献［11］进行测定。

1.3.3 颜色和透明度值的测定

蛋白膜的颜色利用WSC-S 测色色差计进行测定。膜的颜色参数为L*(黑－白)，a*(绿－红)，b*(蓝－ 黄)，其中白板的参数为L*=91.86，a*= －0.88，b*=1.42。透明度值按照参考文献［11］进行测定。

1.3.4 蛋白溶解率和固形物溶解率的测定

将蛋白膜放在含有0.1% 叠氮钠水溶液中，在30 ℃下保温24 h 后，未溶解的蛋白膜利用105 ℃常压干燥测定其重量，溶解在水中的蛋白根据Lowry法［12］进行测定。蛋白膜在水中的蛋白溶解率为溶解的蛋白质量占膜中总蛋白质量的百分数，固形物溶解率为溶解的蛋白膜质量占蛋白膜总质量的百分数。

1.3.5 交联度的测定

蛋白膜用液氮研磨成粉末，在硅胶中干燥一周以上，其交联度利用蛋白膜粉末根据Bubnis 等［13］的方法添加TNBS 进行反应，反应结束后利用乙醚萃取去除未反应的TNBS 和TNP-α-氨基酸，并利用沸水浴去除残留的乙醚后，在346 nm 下测定吸光度值。未添加交联剂的蛋白膜的有效赖氨酸含量为100，交联度计算:

式中，Ac和An分别为添加交联剂和未添加交联剂的样品的吸光度值。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)

蛋白膜利用2%SDS、8 mol/L 尿素、2%β-巯基乙醇、20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)蛋白变性剂进行溶解后，溶解的蛋白利用8%的分离胶在8 mA 电流下进行电泳，然后用考马斯亮蓝R-250 染色液染色，最后用脱色液(V甲醇∶V乙酸∶V水=30∶10∶60)脱色到背景完全透明为止。

1.3.7 傅立叶变换红外光谱( FTIR)

蛋白膜的FTIR 参照Tang 等［14］的方法进行分析。将干燥的蛋白膜粉末与KBr 按1∶100 质量比混合，研磨均匀后压成薄片，利用傅里叶变换红外光谱仪对其进行红外表征，扫描波长范围为4 000 ～400 cm－1。

1.3.8 数据统计与分析

所有数据采用SPSS 16.0 软件(SPSS Inc，Chicogo，IL，USA)分析，用ANOVA 进行方差分析，显著性检验方法为邓肯多重检验，检测限为0.05［15］。

2 结果与分析

2.1 机械性能

表1 显示了添加戊二醛、TGase 对鱼糜-明胶复合膜机械性能的影响。

表1 添加戊二醛/TGase 对鱼糜-明胶复合膜抗拉伸强度(TS)和断裂延伸率(EAB)的影响Table 1 Effect of glutaraldehyde/TGase content on tensile strength(TS)and elongation at break(EAB)of surimi-gelatin composite films

从表1 可以发现，当戊二醛添加量达到蛋白质量0.1%时，鱼糜-明胶复合膜的抗拉伸强度(TS)没有发生显著的变化(P＞0.05)，但进一步提高戊二醛的添加量膜的TS 却出现明显的下降。利用TGase 对蛋白膜进行性质改良时，发现膜的TS 随着TGase 的添加逐渐上升。当TGase 添加量达到蛋白质量的2.5%时，膜的TS 达到对照组的1.4 倍。结果表明TGase 更适合于改良鱼糜-明胶复合膜的机械强度。这与报道的戊二醛与蛋白之间发生过度交联会导致蛋白膜的强度下降［8］，而TGase 与蛋白之间主要是通过酶促反应形成致密的网络结构，可以增强蛋白膜的强度［5，10，16］的结果类似。另一方面，添加一定量的戊二醛或者TGase，膜的EAB 都可以得到提高。通常，EAB 和TS 呈负相关关系［5］，但在本研究中没有发生类似的倾向，这可能是由于戊二醛、TGase 的添加导致膜中蛋白发生共价交联，结果使膜的韧性、延展性都得到增强［17］。

2.2 颜色和透明度值

色泽是评价食品质量的重要指标，而膜的颜色与光的吸收、透过、反射等相关，通过测定膜的颜色可以反映出成膜过程中可能存在的反应，复合膜颜色的测定结果如表2 所示。伴随着戊二醛添加量的增加，膜的L*值、a*值略微下降，而b*值却出现了明显的上升(P＜0.05)。另一方面，添加TGase 对鱼糜-明胶复合膜的L*值、a*值没有显著的影响，但b*值却出现一定程度的下降趋势(P＜0.05)。戊二醛容易与蛋白中赖氨酸的氨基发生反应生成席夫碱［18］，导致膜的颜色发黄，而TGase 只是促进蛋白发生交联反应生成ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸的异肽键［16］，不会对膜的颜色产生影响，因此添加戊二醛比添加TGase 更容易导致鱼糜-明胶复合膜色泽变黄(表2)。

另一方面，由表2 还可以获知，添加戊二醛对鱼糜-明胶复合膜的透明度值没有显著影响(P＞0.05)，但TGase 的添加却导致膜的透明度值下降。在本文中透明度值越高表示蛋白膜越不透明，因此在鱼糜-明胶复合膜中添加TGase 会使膜变得更透明。这可能是TGase 促进鱼糜、明胶之间发生分子间和分子内的交联形成致密均匀的网络结构，减少光的散射作用，导致膜的透光率增加［19］。

表2 添加戊二醛/TGase 对鱼糜-明胶复合膜颜色和透明度值的影响Table 2 Effect of glutaraldehyde/TGase content on color and transparency value of surimi-gelatin composite films

2.3 溶解性

耐水性能是可食膜应用于包装食品时的重要特性，固形物溶解率可以作为蛋白膜的耐水性能指标［20］。膜的固形物溶解率(FS)和蛋白溶解率(PS)的测定结果如表3 所示。

由表3 可以看出，鱼糜-明胶复合膜的FS 为71.80%，说明鱼糜和明胶混合制备的蛋白膜其耐水性能较差。不管是添加戊二醛还是添加TGase，伴随着交联剂的添加，膜的FS、PS 都出现下降的趋势。然而，表3 的结果表明戊二醛对于提高蛋白膜的耐水性能明显优于TGase。与本文结果类似，添加戊二醛可以使棉籽蛋白膜的溶解性降低65%以上［4］，但添加TGase 只能使大豆分离蛋白膜的 FS 下降21.6%［5］，这可能是戊二醛分子量小，容易与蛋白发生交联反应的缘故［18，21］。

2.4 交联度

为了明确戊二醛、TGase 的添加对蛋白交联的影响，利用TNBS 的方法进行了测定，结果如图1 所示。由图1 可知，不管是戊二醛还是TGase 改良的蛋白膜，蛋白交联度随着交联剂的添加都呈逐渐上升的趋势，但添加效果明显不同。添加蛋白质量0.2%的戊二醛时蛋白交联度就达到21%，而TGase 添加量增加到蛋白质量的2.0%时其蛋白交联度也只有17%左右，表明了戊二醛比TGase 更容易促进蛋白之间发生交联反应，结果导致戊二醛添加的鱼糜-明胶复合膜的耐水性能明显优越(表3)。

表3 添加戊二醛/TGase 对鱼糜-明胶复合膜的固形物溶解率(FS)和蛋白溶解率(PS)的影响Table 3 Effect of glutaraldehyde/TGase content on film solubility(FS)and protein solubility(PS)of surimi-gelatin composite films

图1 添加戊二醛/TGase 对鱼糜-明胶复合膜中蛋白交联度的影响Fig.1 Effect of glutaraldehyde/TGase content on crosslinking degree of surimi-gelatin composite films

2.5 SDS-PAGE

SDS-PAGE 分析结果表明，鱼糜-明胶复合膜中的主要蛋白成分为肌球蛋白重链(MHC)、肌动蛋白(Actin)、β 肽链和α 肽链(图2)。伴随着戊二醛的添加，MHC、β 肽链的条带浓度减少，同时浓缩胶顶部的高分子组分(HMWF)的条带浓度逐渐增加，其他蛋白条带没有发现明显的变化，表明戊二醛的添加主要促进鱼糜蛋白中的MHC、明胶蛋白β 肽链之间发生交联形成HMWF。据报道，MHC 和明胶蛋白在TGase 的作用下也会发生类似的交联反应［10，22］。然而，在本研究中TGase 诱导产生的HMWF 含量明显低于戊二醛，进一步验证了戊二醛更容易促进鱼糜-明胶复合膜中蛋白交联反应的发生。

图2 鱼糜-明胶复合膜的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of surimi-gelatin composite films

2.6 FTIR

为进一步了解戊二醛、TGase 的添加对鱼糜-明胶膜中蛋白之间相互作用的影响，利用FTIR 进行了分析(图3)。伴随着蛋白膜中戊二醛含量的增加，代表NH 和OH 伸缩振动的酰胺A 先向高波数方向移动，当戊二醛与蛋白的比例超过0.05%时，该特征峰开始向低波数移动。而随着TGase 含量的增加，酰胺A 逐渐向高波数方向移动，当含量增加至蛋白质量的2.5%时，与对照组相比移动了48.4 cm－1。据报道，蛋白膜的酰胺A 特征吸收峰向高波数方向移动表示膜中的氢键作用相对减弱［23］。因此，图3 的结果表明了少量的戊二醛可以使膜中蛋白分子间/分子内的氢键作用相对减弱，但过量的戊二醛可能在促进蛋白交联的同时也破坏了蛋白的三维结构，导致亲水性自由基增多［24］，氢键作用相对增强(图3)。从图3 还可以看出，戊二醛的添加使酰胺Ⅰ(C = O 伸缩振动)、酰胺Ⅱ(NH 变形振动或CN 伸缩振动)向高波数方向发生轻微移动，而TGase 对这2 个特征吸收峰没有产生明显的影响，表明戊二醛的添加使膜中蛋白的二级结构发生变化［25］，而且戊二醛还可能与蛋白中的氨基发生交联形成新的C－N 键。

3 结论

戊二醛和TGase 的添加对鱼糜-明胶复合膜性能的影响效果明显不同。戊二醛的添加不能提高膜的机械强度，也不会改变膜的透明性，但可以大幅度增加膜的耐水性能，使膜的颜色变黄。然而，添加TGase 不仅可以改良膜的机械性能、耐水性能和透明性，而且不会影响膜的色泽。根据SDS-PAGE 和FTIR 的结果，发现戊二醛和TGase 都可以使成膜的蛋白分子之间发生交联形成高分子聚合物，但戊二醛还可能使蛋白的二级结构发生变化，导致蛋白成膜性能下降。因此，本研究的结果表明TGase 更适合用于改良鱼糜-明胶复合膜的理化性能。

图3 添加戊二醛/TGase 的鱼糜-明胶复合膜的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of surimi-gelatin composite films

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