胶体金免疫层析技术快速检测蜂蜜中5-羟甲基糠醛*

刘自平，李静，吴春霞，张雨，李海涛，戴一

(安徽新华学院 药学院，安徽 合肥，230088)

5-羟甲基糠醛［1］(HMF)是天然蜂蜜与加工蜂蜜中的还原糖经加热、脱水生成的一种黄色、具有难闻气味的有毒物质。在酸性条件下［2］，蜂蜜中的氨基化合物与葡萄糖发生Mailard 反应或者蜂蜜中的还原糖发生脱水反应，生成HMF。HMF 的存在不仅会导致蜂蜜风味的改变和颜色的加深，而且会影响到蜂蜜食用的安全性。此外，HMF 对眼睛、黏膜或皮肤有刺激性，摄入过多会引起中毒，甚至引发癌症、造成动物横纹肌麻痹和内脏损伤。因此，在国际贸易中HMF含量属于强制性检测指标之一［3］，我国国家标准GB/T18796 －2012 规定要求每千克蜂蜜中HMF 的含量应小于40 mg。目前蜂蜜中HMF 的检测主要采用分光光度法及高效液相色谱法［4－5］，但这2 种方法都需要在实验室内完成检测，无法满足现场快速测定的需要。随着胶体金免疫技术的快速发展，其在食品现场快速筛查与检测方面的应用也越来越广泛，但目前，并没有利用胶体金免疫层析技术在快速检测HMF 方面的应用，因此，本研究利用胶体金标记HMF的单克隆抗体，制成检测试纸条，以满足现场快速检测蜂蜜中HMF 的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯金酸(国药集团化学试剂有限公司);牛血清蛋白、羊抗鼠二抗(上海捷宁生物科技有限公司);抗HMF 单克隆抗体、牛血清白蛋白-HMF(BAS-HMF)(本实验室自制);柠檬酸三钠(上海青析化工有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸(均为美国Millipore)，台式高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)，分光光度计(Beckman Du 公司)，磁力搅拌器(北京北科思拓仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 胶体金的制备

1.2.1.1 胶体金制备方法

参照文献［6－7］，取硅化处理过的1 个250 mL 三角瓶，向其中加入100 mL 三蒸水及1 mL 1% 氯金酸，加热至沸腾后，加入2.4 mL 1%柠檬酸三钠，起初溶液颜色为黑色，接着变蓝，最后变为酒红色，关掉电源，继续磁力搅拌反应5 min，冷却即得胶体金。

1.2.1.2 胶体金颗粒大小的制备

A 液(80 mL):1%氯化金，l mL;双重蒸馏水，79 mL;B 液(20 mL):1%柠檬酸钠，4 mL;1%单宁酸，0. l mL;双重蒸馏水，15.8 mL;25 mmol/L K2CO3，0.1 mL;将上述A 液加热到60℃，然后将B 液快速加入到A 液中，继续搅拌，在极短的时间内加热到煮沸(大约10 min)，颜色由黑→蓝→酒红色。pH 值调到所需要求。上述用量合成的胶体金颗粒为10nm，根据所加入鞣酸量的不同，可合成3 ～17 nm 颗粒大小的胶体金，在鞣酸-柠檬酸钠还原法中，柠檬酸钠是主要的还原剂;而鞣酸则具有双重作用，既起还原作用，也有保护作用，它控制着“晶核”的形成过程，故可改变鞣酸的用量来制备不同颗粒的胶体金。按照文献［7］，用分光光度计对胶体金在可见光范围(400 ～600 nm)进行扫描，发现其主峰宽度较小，表明制备胶体金颗粒较均匀;其最大波长为521 nm，表明其颗粒度为20 nm。用20 nm 胶体金颗粒标记抗HMF 特异性单克隆抗体。

1.2.1.3 完全抗原(BAS-HMF)制备

用琥珀酸酐将半抗原HMF 和载体蛋白BAS 偶联，形成完全抗原BAS-HMF。

1.2.1.4 抗HMF 单克隆抗体的制备

取BAS-HMF 稀释于生理盐水中共0.3 mL，加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，腹腔注射于小鼠0.2 mL/只。14d 后，取75 μgBAS-MHS-HMF 交联物，加弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射上述小鼠后，取免疫小鼠尾静脉进行效价测定，同时做小分子的竞争实验，效价达到1∶32 万，血清竞争达到1 000 ng，即可小鼠尾静脉注射加强免疫，3d 后常规融合，包被HMF-TG 交联物(1 mg/L)以间接ELISA 方法进行筛选，取阳性孔且有竞争的克隆孔以有限稀释法进行克隆化。阳性率达到100%后，扩大培养收集细胞注射小鼠腹腔7d 后收集腹水。

1.2.2 胶体金-抗HMF 特异性单克隆抗体的制备

取50 mL 胶体金，用K2CO3调pH 值至8.0 左右，加10 μL 抗HMF 单抗的腹水，室温振荡30 min，加入一定量的BSA 使其终含量为1%，室温振荡1 h。离心(12 000 r/min，4℃)20 min，弃去上清液，用50 g/L 蔗糖、10 g/L BSA 和200 mg/L 叠氮钠的PBS 重悬沉淀，即得腹水标记胶体金的复合物。制备好的复合物用0.22 μm 滤膜过滤后4℃下保存。

1.2.3 胶体金单克隆抗体免疫层析试纸条的组装

将牛血清蛋白-HMF 交联物和羊抗小鼠IgG 分别画线于硝酸纤维膜上，作为样品检验区(T 线)和质控区(C 线)，在玻璃纤维膜上喷涂有胶体金标记的HMF 单抗(金标垫)。(见图1)

图1 胶体金免疫层析试纸条结构图Fig. 1 Chart of colloidal gold immunoch romatographic strip

2 结果与分析

2.1 样品的检测及其结果的判断

检测时，将150 μL 蜂蜜样品滴加于试纸条的样品孔中，受毛细作用力向金标垫层析，随后金标垫上的胶体金标记物复溶于溶液中并随溶液一起向吸水纸处移动，经过T、C 线时先后与其包被的抗原抗体发生抗原抗体反应。结果当样品中HMF 的含量 =39.5 mg/kg，T 线显示紫红色条带，与C 线相比颜色较浅，即样品中HMF 的含量＜40 mg/kg，则过量的胶体金标记物与T 线上蛋白特异性结合形成紫红色条带，为阴性;当样品中HMF 含量= 40 mg/kg，则T 线不显色，即样品中HMF 含量≥40 mg/kg，由于金标抗体先与样品中的HMF 结合，使得金标记物不能和T线上蛋白结合，因而呈现无色，为阳性。无论蜂蜜中HMF 的含量是多少，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够的蜂蜜样品，层析过程是否正常的标准，同时也是作为试剂的内控标准。所以当C 线不显色时说明检测结果无效(见图2)。由于个人对色彩的敏感度不同，通过本试纸条检测出的蜂蜜中HMF 含量存在±0.5 mg/kg 误差。

图2 试纸条结果判定Fig.2 Test results

2.2 试纸条检测

2.2.1 试纸条特异性测定

由于在制备检测试纸过程中，T 线位置使用HMF-BSA 作为抗原，如果制备的HMF 单克隆抗体与BSA 有交叉反应，会导致假阴性结果，因此本研究采用间接酶联免疫吸附法(ELISA 法)，将HMF-BSA 和BSA 分别包被酶标板，封闭后加入辣根过氧化物酶标记的抗HMF 单克隆抗体，洗涤后以TMB/H2O2显色。结果显示，抗HMF 单克隆抗体可以识别羟甲基糠醛-BSA，并且与BSA 没有任何的交叉反应。将HMF，乙醇，葡萄糖，糠醛等分别与同种天然蜂蜜混合配制成50 ～100 mg/kg 浓度的溶液进行检测，除羟甲基糠醛在试纸条上不显紫红色，呈阳性外，其余都呈阴性。说明本实验研究的羟甲基糠醛检测条对羟甲基糠醛具有特异性。

2.2.2 检测范围

本试纸条的检测范围设定为40 mg/kg。当蜂蜜中的HMF 中的含量≥40 mg/kg 时，检测线(T 线)位置不出现紫红色条带呈阳性，当蜂蜜中的HMF 中的含量＜40 mg/kg 时，检测线(T 线)位置出现紫红色条带呈阴性。

2.2.3 准确性

用该试纸条对20 份蜂蜜中HMF 进行了检测并与分光光度法及液相色谱法检测结果作比较，检测试剂以40 mg/kg 为判定极限，没有出现假阳性及假阴性，检测结果与分光光度法及液相色谱法结果完全相符。

2.2.4 灵敏度

将1 g/kg 的标准品HMF 母液(1 gHMF 溶于1 kg 丙酮)用磷酸缓冲液系列稀释成38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5 mg/kg，分别向4 个试纸条样品垫上加入150 μL 上述稀释好的标准品溶液，在另一个试纸条的样品垫上加入150 μL 磷酸缓冲液做阴性对照，5 min 后观察T、C 线的颜色，重复5 次，结果如表1 所示。当加入不含HMF 或HMF 质量浓度＜40 mg/kg 时，T 线的颜色与C 线相近或稍浅;当HMF的质量浓度≥40 mg/kg 时，T 线基本消失。由此可见，HMF 的质量浓度＜40 mg/kg 时，结果为阴性;HMF 的质量浓度≥40 mg/kg 时，结果为阳性。该试纸条的最低检测线为HMF 的质量浓度小于40 mg/kg。

表1 不同浓度HMF 标准品的测定结果Table 1 The test results of different HMF standard concentration

3 结论

本试纸条主要用于定性检测蜂蜜中HMF 含量，其灵敏度和特异性较好。与ELISA 法的比对结果显示，准确度也较好。研究通过调节试纸条中PVC 板上的胶体金标记的单克隆抗体的含量和检测线(T线)位置的HMF-BSA 抗原的量，将免疫层析试纸条的检测值范围设定在40 mg/kg，HMF 中的含量≥40 mg/kg 时，检测线(T 线)位置不出现紫红色条带呈阳性，当蜂蜜中的HMF 中的含量＜40 mg/kg 时，检测线(T 线)位置出现紫红色条带呈阴性。利用胶体金免疫层析技术消费者可以在购买蜂蜜的现场对蜂蜜中的HMF 的含量进行定性鉴别，从而鉴别蜂蜜的新鲜程度，是否掺假以及热加工处理条件，并且胶体金层析技术的(GICA)灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简便快速，分析结果准确且可通过肉眼直接判定结果，适合消费者购买蜂蜜时现场鉴别蜂蜜质量的优劣。

［1］ 刘静，曹炜. 蜂蜜中羟甲基糠醛的研究进展［J］. 中国蜂业，2011，62(1):11 －12.

［2］ 张房宇. 紫外风光光度法与液相色谱法测定蜂蜜5-羟甲基糠醛的差异探讨［J］. 中国蜂业，2009，60(2):9 －12.

［3］ GB/T18796 2012 蜂蜜［S］．

［4］ GB/T 18932 －2012 蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法液相色谱-紫外检测法［S］.

［5］ Kelly J D，Petisco C，Downey G． Potential of nearinfrared transflectance spectroscopy to detect adulteryation of irish honey by beet invert syrup and high fructose coin syrup［J］． J Near Infrared Spectroscopy，2006，14:139 －146.

［6］ 徐霞玲，向军俭，唐勇，等. 猪肉中1-氨基乙内酰脲的胶体金免疫层析法快速检测［J］. 分析测试学报，2010，29(7):680 －685.

［7］ 高利利，程金平，刘元嫄，等. 软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的研制［J］. 环境科学，2011，32(8):2 492 －2 496.