食品中腐败酵母的实时荧光PCR 鉴定

陈世琼，逄波，蔡雪凤，伊鋆，郭铮蕾，付浦博，饶红

1(国家食品质量安全监督检验中心，北京，100094)2(中国疾病预防控制中心，北京，1022062)

3(北京市出入境检验检疫局，北京，100026)

近几年来，由于食品防腐剂和辐照技术的普遍应用，造成酵母菌引起的食品腐败问题越来越多。此外，在低pH 值、低水活性、低湿度、含盐量或含糖量高的食品中，由于酵母菌的抵抗力较强，其食品腐败也多由酵母菌引起。食品腐败不仅造成经济损失，而且给消费者的健康带来威胁。容易发生酵母菌腐败的产品有发酵食品、腌渍食品、浓缩果汁、蜂蜜、果酱、肉、海产食品、奶制品、焙烤食品、饮料等。

酿酒酵母、鲁氏接合酵母、斯巴达克毕赤酵母和布鲁塞尔德克酵母等在食品中的残留均可导致食品腐败。其中，鲁氏接合酵母是最常见的嗜渗酵母，常引起糖浆、果酱、果汁等高糖食品的变质［1－7］。酿酒酵母是常见的导致果汁腐败的酵母［8－10］。其他酵母导致食品腐败的事件也有报道。本文针对酿酒酵母、鲁氏接合酵母、斯巴达克毕赤酵母和布鲁塞尔德克酵母的基因保守序列，设计或筛选实时荧光PCR 鉴定用的探针引物，建立了针对这4 种酵母的实时荧光PCR 鉴定方法，并用所建立的方法对分离自市售食品的未知酵母进行了鉴定。实时荧光PCR 方法鉴定酵母，全过程仅需约3 h，与常用的生化鉴定方法相比，实时荧光PCR 方法简化了鉴定步骤，提高了鉴定准确性，缩短了鉴定时间。

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究使用的菌株见表1。

表1 本研究使用的菌株Table 1 Strains used in this study

其中，编号为1 ～4 的酿酒酵母、鲁氏接合酵母、布鲁塞尔德克酵母及斯巴达毕赤酵母为目的标准菌株;5 ～13 为参比菌株，其中，10 为黑曲霉(ATCC 16404)，11 ～13 为细菌，其他食品中常见的其他腐败酵母。14 ～75 为分离自蜂蜜、糕点、水或饮料的未知酵母。

1.2 仪器及试剂

实时荧光PCR 仪(ABI 7300);生化培养箱。

反应预混液(2 ×TaqMan Universal Master Mix，ABI)(Cat. No. :4427788);酵母基因组提取试剂盒(Cat. :No. :DP 307 －02)，天根生化科技有限公司(以下简称天根公司);细菌基因组提取试剂盒(Cat. No. :DP 302 －02)，天根公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的培养及DNA 提取

将表1 中的菌株用表2 中的培养基及培养条件培养，取培养液用天根公司酵母或细菌基因组提取试剂盒提取DNA。

表2 本研究使用菌株的培养条件Table 2 Culture conditions used in this study

1.3.2 探针、引物的设计、选择及检测方法的建立

(1)探针、引物的设计及合成

酿酒酵母的探针、引物由文献［13］查得。鲁氏接合酵母、布鲁塞尔德克酵母及斯巴达毕赤酵母的探针、引物根据其ITS1、5.8 S、ITS2 序列设计。所有引物、探针均由上海英骏生物技术有限公司合成。

(2)实时荧光PCR 检测方法的建立

分别以表1 中目的菌株和参比菌株(1 ～13)的DNA 为模板，配制20 μL 实时荧光PCR 反应体系，组成如下:含10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探针(10 μmol/L)1 μL，模板50 ～100 ng，用灭过菌的双蒸水补足至20 μL。在ABI 7300 扩增，根据Ct 值判断探针、引物的有效性和特异性。4 种目的酵母的实时荧光PCR 扩增条件见表3。

表3 实时荧光PCR 鉴定方法的扩增条件Table 3 Amplification conditions of real-time PCR identification method

(3)实际样品中分离出的未知酵母菌的鉴定

分别使用针对不同目的菌株的探针、引物，以表1 中未知菌株的DNA 为模板，配制20 μL 实时荧光PCR 反应体系，组成如下:含10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探针(10 μmol/L)1 μL，模板50 ～100 ng，用灭过菌的双蒸水补足至20 μL。在ABI 7300 上扩增，根据Ct值判断未知酵母是否是所要鉴定的酵母菌。

2 实验结果与分析

2.1 实时荧光PCR 法鉴定4 种腐败酵母探针、引物的有效性及特异性实验

筛选或设计的针对4 种腐败酵母鉴定用的探针、引物的有效性及特异性试验结果见表4。

表4 针对4 种腐败酵母实时荧光PCR 法鉴定用的探针、引物的有效性及特异性实验结果Table 4 Effectiveness and specificity of the probes and primers for the 4 kinds of spoilage yeast

从表4 可以看出，本研究所设计或筛选的针对酿酒酵母、鲁氏接合酵母、布鲁塞尔德克酵母及斯巴达毕赤酵母实时荧光PCR 探针和引物对目的菌株有高度的特异性，在本研究所使用的扩增条件下，4 种目的菌株的扩增曲线的Ct 值分别为21.07、28.60、25.50 和24.04，其他酵母、曲霉和细菌标准菌株或参比菌株扩增曲线的Ct 值均显示为“UNDETECT”。说明所使用的引物和探针对各自的目标酵母菌具有特异性。

2.2 分离自样品的未知酵母实时荧光PCR 方法快速鉴定

分别使用针对酿酒酵母、鲁氏接合酵母、布鲁塞尔德克酵母及斯巴达毕赤酵母实时荧光PCR 方法鉴定用的探针和引物，以分离自食品样品的60 余株未知酵母的DNA 为模板，使用ABI 公司生产的反应预混 液(2 ×TaqMan Universal Master Mix，ABI)(Cat. No. :4427788)配制20μL 反应体系，使用表3中的扩增条件，对分离自食品样品的60 余株未知酵母进行快速鉴定。

鉴定结果发现，编号为10 －1、10 －2、10 －3 及10 －5 的4 株菌为酿酒酵母，他们均分离自果汁饮料。另外，有21 株为鲁氏接合酵母，其实时荧光PCR反应Ct 值均在24 ～29 之间，全部分离自蜂蜜样品。60 余株未知酵母中的约35 株为与酿酒酵母、鲁氏接合酵母、布鲁塞尔德克酵母及斯巴达毕赤酵母不同的酵母菌，有待进一步鉴定。

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