ANXA2表达对Caco2细胞形态影响的扫描电镜观察

谢 楠，牟茂森，孙梦瑶，于 翔，高 宁，何慧敏，王晓静，王绮轩，胥谨慧，胡妍妍，侯颖春

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062）

膜联蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）是钙依赖性磷脂结合蛋白Annexins超基因家族中的成员，人类的ANXA2结构基因位于15q21～q22．ANXA2由339个氨基酸组成，相对分子质量为36kDa，由33kDa的C端结构域和3kDa的N端结构域组成．ANXA2主要以单体和异四聚体（ANXA22／p112）形式存在于人体内皮细胞、单核／巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中［1］．大量研究表明，ANXA2在多种类型的肿瘤中过表达，其在调节肿瘤细胞的黏附、侵润、增殖、迁移、凋亡等活动中起重要作用［2］．

结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，ANXA2在人结直肠癌组织高表达，可能与结直肠癌的发生、发展密切相关［3］．RNA干扰（RNAi）技术是研究基因功能的重要方法之一，在肿瘤基因治疗方面也具有很大潜力．该技术通过靶mRNA序列特异双链小RNA分子（19－25bp）介导序列特异性转录后基因沉默，从而实现对靶基因表达的强有力阻断［4］．本实验以人结直肠癌细胞（Caco2）为研究对象，采用RNAi技术抑制Caco2细胞中的ANXA2基因表达，研究ANXA2表达对Caco2细胞形态及表面与细胞运动密切相关的超微结构的影响，以期为揭示ANXA2在结直肠癌时扮演的作用提供外观形态学方面的资料，为以ANXA2为靶基因对人结直肠癌进行基因治疗积累实验资料．

1 材料与方法

1．1 siRNA及其表达质粒

Caco2细胞株购自美国ATCC；表达ANXA2特异性siRNA的质粒pU6H1－GFP－siANXA2及错义siRNA对照质粒pU6H1－GFP－siRNASCR由百奥生物技术有限公司（南通）构建合成．

siRNA序列由我们设计，ANXA2特异性siRNA序列：TGTGTGGTGGAGATGACTGA；

错义对照siRNA序列：GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC．

1．2 实验试剂及仪器

Endo－free Plasmid Mini Kit II为Omega产品；DMEM培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素、链霉素、庆大霉素及胰蛋白酶为Amresco公司产品；STranG转染试剂购自南京探求生物技术公司；电镜级戊二醛固定液为Sigma产品．

DMIL LED倒置荧光显微成像系统：德国徕卡公司；Quanta 200环境扫描电子显微镜：荷兰FEI公司；K850临界点干燥仪：英国Emitech公司；E－1010离子溅射镀膜仪：日本日立公司．

1．3 方法

1．3．1 质粒制备 质粒pU6H1－GFP－siANXA2及pU6H1－GFP－siRNASCR的制备参照Endo－free Plasmid Mini Kit II说明书进行．

1．3．2 细胞培养及转染 Caco2细胞用DMEM完全培养液（含10%胎牛血清、100μg／mL青霉素、100μg／mL链霉素、100μg／mL庆大霉素），于37℃、5%CO2条件下培养．将对数生长期细胞以1．5×105个／皿接种于含有无菌盖玻片的30mm培养皿中，待细胞贴壁率达60%～70%时将质粒pU6H1－GFP－siANXA2和pU6H1－GFP－siRNASCR分别以每皿4．5μg的用量导入细胞内（S－TranG转染试剂说明书）．设野生对照组（未转染的Caco2）．每24h更换一次培养基．转染60h后，用倒置荧光显微镜（激发光波长为488nm）检测细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达情况以估算转染效率：转染效率＝绿色荧光细胞数／视野下细胞总数×100%．

1．3．3 环境扫描电子显微镜制样 分别于转染后24、48、72、96和120h在各组取出铺有细胞的盖玻片进行扫描电镜制样：（1）用PBS洗3次，每次5 min；（2）2．5%电镜级戊二醛4℃下固定60min；（3）预冷三蒸水洗3次，每次5min；（3）酒精逐级（30%，50%，75%，85%，95%，100%，100%）脱水，每级2min；（4）乙酸异戊酯置换乙醇；（5）临界点干燥；（6）真空镀金；（7）环境扫描电子显微镜观察，数码成像系统进行图像采集．

2 结果

2．1 质粒转染效率

转染重组质粒60h后细胞GFP的表达如图1所示．转染效率＞80%．

图1 转染60h后Caco2细胞内GFP表达水平（×10）Fig．1 GFP expression in Caco2cells at 60hpost transfection

2．2 环境扫描电子显微镜观察

图2Caco2细胞环境扫描电子显微镜观察Fig．2 ESEM images of Caco2cells

环境扫描电子显微镜观察结果显示，野生对照组细胞整体形态丰满，表现很好的贴壁状态，细胞多成六边形或多角形；细胞表面富致密的微绒毛；几乎每个细胞都有发达的多而长的伪足自细胞膜处伸出到无细胞区，并与其它邻近细胞伸出的伪足相互紧密嵌合或连接（图2，A，B）．错义对照组细胞（即转染重组质粒pU6H1－GFP－siRNASCR的Caco2细胞）形态与野生对照组细胞基本一致，且随时间延长到120h时细胞形态仍无明显变化（图2，C，D，E，F，G）．干扰组细胞（即转染重组质粒pU6H1－GFP－siANXA2的Caco2细胞）形态及表面结构在转染后出现变化，而且这种变化随时间延长愈加明显．转染24h后，干扰组细胞（图2，H）与错义对照组细胞（图2，C）相比整体形态无显著变化，但细胞表面微绒毛及伪足结构均略有减少．转染48h后，干扰组细胞（图2，I）形态与错义对照组细胞（图2，D）相比出现较明显变化，边界变模糊，细胞表面微绒毛进一步减少，而且细胞伪足变得更加纤细并排列更加稀疏．转染72h后，干扰组细胞（图2，J）与错义对照组细胞（图2，E）相比边界变得更加模糊，且细胞开始变形，细胞表面微绒毛大量消失，而且伪足明显变少并多数断裂变短，且方向性差．转染96h后，干扰组细胞（图2，K）与错义对照组细胞（图2，F）相比，其外形变为接近圆形的不规则形状，细胞体积明显变小，细胞表面微绒毛几乎全部消失，使细胞表面趋于光滑，仅有少数的伪足存在，且伪足长短、粗细不均，分布杂乱．转染120h后，干扰组细胞（图2，L）与错义对照组细胞（图2，G）相比，体积进一步缩小，细胞表面微绒毛及伪足结构均近乎完全消失，另外可见部分细胞膜区域出现褶皱现象．

3 讨论

ANXA2作为一种多功能的钙依赖性磷脂结合蛋白，参与许多生命活动：调节Ca2＋依赖的膜性生物学活动［5］；稳定细胞骨架［6］；促进DNA合成及肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移［7］；并在血管生成过程中起重要作用［8］．大量研究表明，ANXA2在多种肿瘤中表达失调，并与肿瘤的发生发展密切相关．结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，我们前期研究已证明以ANXA2为靶基因设计合成的干扰重组质粒pU6H1－GFP－siANXA2可在mRNA及蛋白水平显著下调ANXA2在Caco2细胞中的表达，进而抑制Caco2细胞的增殖、迁移等生物学行为并促进细胞凋亡［9］．在此基础上，将干扰重组质粒pU6H1－GFP－siANXA2导入Caco2细胞后，以扫描电镜观察了ANXA2表达对Caco2细胞形态及表面超微结构影响．环境扫描电镜观察显示，Caco2细胞内ANXA2表达被抑制后，细胞由伸展性良好的六边形或多角形逐渐收缩变小，成为圆形或不规则形状；细胞表面微绒毛及伪足等结构的形成受到明显抑制，并随时间延长而加剧，最终Caco2细胞表面原本十分发达的、与细胞活跃的运动力相关的结构几乎全部消失，细胞表面趋于光滑．肿瘤细胞表面大量微绒毛的存在可扩张细胞表面积，增强细胞与周围环境的物质交换及信息交流；同时大量微绒毛存在可使细胞表面粘液不至流失，保持细胞表面滑润，减少细胞所受磨擦及由此造成的细胞损伤［10］．Caco2细胞表面微绒毛的减少势必会削弱细胞与胞外基质间的相互作用，使得一些信息在细胞与环境间传递错误或中断；微绒毛减少也将导致细胞的防御能力下降，从而影响细胞的正常生命活动，同时，微绒毛也是细胞自身的运动器官之一，故微绒毛的减少也势必抑制细胞的运动力．发达的伪足结构是肿瘤细胞活跃的运动力和侵袭力的最重要的结构基础和有别于正常细胞的明显特征．伪足对肿瘤细胞运动、侵袭、黏附、摄取营养、支持等过程起关键作用，而且对肿瘤细胞突破血管壁的基底膜至关重要［11］，故而是肿瘤转移的重要结构基础，这种结构受损，必然会使细胞的侵袭、运动、转移能力减弱．

ANXA2的C端结构域含有丝状肌动蛋白（F－actin）结合位点，其在调节肌动蛋白骨架重排、维持肌动蛋白骨架可塑性等活动中起重要作用［6］．Caco2细胞ANXA2表达被抑制后，可能导致细胞内Rho蛋白活性降低［12－13］，抑制Rho／ROCK／LIMK／Cofilin通路活化肌动蛋白结合蛋白Cofilin［14］，从而可能导致与F－actin结合的细胞骨架蛋白Fascin表达水平降低［15］．也可能导致AHNAK－ANXA22／p112－F－actin［16］、Src－ANXA22／p112－F－actin［17］、CEACAM1－ANXA22／p112－F－actin［18］、CD44－ANXA22／p112－F－actin［19］等与F－actin活动紧密相关的复合体形成受阻．通过以上途径，下调ANXA2的表达可能将干扰细胞内F－actin的解聚、重排等正常活动，从而影响细胞表面以F－actin为主要组分的伪足及微绒毛等突起结构的形态变化．同时，ANXA2表达被抑制后，还可能通过细胞骨架网络改变影响细胞质膜的活性及动力学特性［5］，使细胞收缩变形、黏附性下降．此外，随转染后时间的延长，部分细胞表面膜结构出现褶皱或不完整状态，显示细胞凋亡现象．这是由于抑制ANXA2表达可能影响一些凋亡相关因子（如：前胃泌素、p53等）活性，进而触发一系列信号反应，诱发细胞内凋亡信号通路［7，20］的启动，从而使细胞出现凋亡表型．

4 结论

本实验以RNAi技术抑制ANXA2表达后，Caco2细胞形态及表面超微结构出现明显变化．主要表现为细胞缩小变形；细胞表面微绒毛及伪足等突起结构受损，逐渐减少甚至消失；最终一些细胞出现膜褶皱、不完整等凋亡表型．说明ANXA2表达与Caco2细胞表面形态变化密切相关，ANXA2在此过程中的具体作用机制有待进一步研究．此研究为进一步探索ANXA2在结直肠癌发展过程中的作用以及结直肠癌基因治疗提供细胞形态方面的依据．

［1］李鹏鸽，杨艳丽，葛玉婷，等．膜联蛋白A2在肿瘤生长调节与细胞骨架活动中的作用［J］．生理科学进展，2010，41（6）：457－460．

［2］Lokman N A，Ween M P，Oehler M K，et al．The role of annexin A2in tumorigenesis and cancer progression［J］．Cancer Microenvironment，2011，4：199－208．

［3］Duncan R，Carpenter B，Main L C，et al．Characterisation and protein expression profiling of annexins in colorectal cancer［J］．British Journal of Cancer，2008，98：426－433．

［4］Shan Ge．RNA interference as a gene knockdown technique［J］．The International Journal of Biochemistry＆Cell Biology，2010，42：1243－1251．

［5］Babiychuk E B，Draeger A．Annexins in cell membrane dynamics：Ca2＋－regulated association of lipid microdomains［J］．The Journal of Cell Biology，2000，150（5）：1113－1123．

［6］Hayes M J，Shao D，Bailly M，et al．Regulation of actin dynamics by annexin 2［J］．The EMBO Journal，2006，25：1816－1826．

［7］宋魏，仇晓菲．AnnexinⅡ与肿瘤的研究进展［J］．医学综述，2008，14（6）：851－853．

［8］Sharma M，Ownbey R T，Sharma M C．Breast cancer cell surface annexinⅡinduces cell migration and neoangiogenesis via tPA dependent plasmin generation［J］．Experimental and Molecular Pathology，2010，88：278－286．

［9］章蔼然，潘宁，侯颖春．ANXA2基因表达水平对人结直肠癌细胞增殖及运动的影响［J］．陕西师范大学学报：自然科学版，2009，37（6）：71－76．

［10］李继承，俞寿民．间皮细胞微绒毛的超微结构和功能［J］．科技通报，1989，5（5）：44－48．

［11］周方正，伍钢．细胞伪足与肿瘤转移研究进展［J］．临床肿瘤学杂志，2007，12（1）：77－79．

［12］Babbin B A，Parkos C A，Mandell K J，et al．Annexin 2 regulates intestinal epithelial cell spreading and wound closure through Rho－related signaling［J］．The American Journal of Pathology，2007，170（3）：951－966．

［13］Rescher U，Ludwig C，Konietzko V，et al．Tyrosine phosphorylation of annexin A2regulates Rho－mediated actin rearrangement and cell adhesion［J］．Journal of Cell Science，2008，121（13）：2177－2185．

［14］Graauw Md，Tijdens I，Smeets M B，et al．Annexin A2 phosphorylation mediates cell scattering and branching morphogenesis via cofilin activation［J］．Molecular and Cellular Biology，2008，28（3）：1029－1040．

［15］Hou Y，Yang L，Mou M，et al．Annexin A2regulates the levels of plasmin，S100A10and fascin in L5178Y Cells［J］．Cancer Investigation，2008，26（8）：809－815．

［16］Benaud C，Gentil B J，Assard N，et al．AHNAK interaction with the annexin 2／S100A10complex regulates cell membrane cytoarchitecture［J］．The Journal of Cell Biology，2004，164（1）：133－144．

［17］Hayes M J，Moss S E．Annexin 2has a dual role as regulator and effector of v－Src in cell transformation［J］．The Journal of Biological Chemistry，2009，284（15）：10202－10210．

［18］Kirshner J，Schumann D，Shively J E．CEACAM1，a cell－cell adhesion molecule，directly associates with annexinⅡin a three－dimensional model of mammary morphogenesis［J］．The Journal of Biological Chemistry，2003，278（50）：50338－50345．

［19］Oliferenko S，Paiha K，Harder T，et al．Analysis of CD44－containing lipid rafts：recruitment of annexinⅡand stabilization by the actin cytoskeleton［J］．The Journal of Cell Biology，1999，146（4）：843－854．

［20］Huang Y，Jin Y，Yan C H，et al．Involvement of annexin A2in p53induced apoptosis in lung cancer［J］．Molecular Cell Biochemistry，2008，309：117－123．