二氢卟吩e6光动力学疗法对食管癌Eca—109细胞增殖迁移的影响

张 坤，崔连新，康 玲，2，王筱冰＊，刘全宏

（1陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062；2新疆医科大学 公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐830011）

食管癌（Esophageal Cancer，EC）是由食管黏膜上皮或腺体发生恶性增殖导致的肿瘤，是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一．在我国，食管癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第二位［1］．目前，食管癌发生的早期诊断还很困难，其发现多为中晚期，而食管癌的早期转移和术后复发是造成人死亡的重要原因．食管癌目前的主要治疗手段仍然是传统的放疗、化疗及手术疗法，但体质虚弱的临床患者，常不能耐受手术和放化疗．而且，食管是人进食的必需管道，其癌变的发生使得患者进食困难，生活质量下降，最终影响其生存状况．

肿瘤光动力疗法（Photodynamic Therapy，PDT）是近30年兴起并不断发展的肿瘤治疗技术，其原理主要是利用光敏剂能特异性选择聚集在肿瘤组织内，经特定波长的光照激发，产生单线态氧等自由基对肿瘤组织进行杀伤．PDT具有对肿瘤组织选择性和特异性高、对正常组织毒性低等优点，且其可与传统治疗手段同时应用．在PDT过程中，光敏剂的选择起到至关重要的作用．目前PDT临床治疗中，应用最多的主要是以血卟啉及其衍生物（Hematoporphyrin Derivative，HpD）为代表的第一代光敏剂．已有研究表明，光动力疗法在治疗Barrett食管（BE）及早期食管癌方面已经取得较好疗效［2－4］．但由于血卟啉及其衍生物有成分不清楚、代谢周期慢、毒副作用强等缺点，影响肿瘤的治疗效果．因此，寻找和开发成分单一稳定、对肿瘤选择性高的第二代光敏剂是光动力治疗肿瘤领域一个重要问题．二氢卟吩e6（Chlorin e6，Ce6）是一种单体四吡咯化合物，属于叶绿素类光敏剂，其经光照射后的单线态氧产率高，且具有对肿瘤选择性强、体内清除速度快、毒副作用小等特点．已有研究发现，激光结合二氢卟吩e6对黑色素瘤可以产生明显的抑制效应［5］，但有关Ce6－PDT在食管癌治疗方面的报道尚少．

本实验主要研究二氢卟吩e6介导的光动力疗法对人食管癌细胞Eca—109的影响，通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和划痕实验检测Ce6－PDT对Eca—109细胞的增殖及细胞迁移的影响，初步探讨光敏剂二氢卟吩e6对体外食管癌细胞光动力杀伤效应，以期为光敏剂治疗食管癌提供科学依据．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要试剂 RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibco公司，胰蛋白酶，四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；二氢卟吩e6购自美国Frontiersci公司．

1．1．2 主要仪器 CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）、荧光倒置显微镜（德国Leica公司）、Exl800酶标仪（美国BioTek公司）、高速冷冻平板离心机（德国Eppendorf公司）、半导体激光仪（西北大学光电子技术重点实验室）．

1．1．3 细胞培养 人食管癌细胞株Eca—109购自南京凯基生物有限责任公司，在含15%小牛血清的RPMI1640培养基中，37摄氏度5%CO2培养箱中常规培养，实验用细胞处于对数生长期．

1．2 方法

实验前调整细胞密度为1×104cells／mL，接种于96孔板，每孔200μL，置于培养箱中培养24h后开始实验，实验后每孔加入5mg／mL的3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（MTT）20 μL，继续培养4h，离心，吸弃上清，每孔加100μL二甲基亚砜，震荡15min，用酶标仪在570nm处测定各孔吸光度OD值，计算细胞存活率，细胞存活率（%）＝实验组OD值／对照组OD值×100%．实验中每组设5个复孔，整个实验重复3次．

1．2．1 不同浓度Ce6对食管癌Eca—109细胞增殖的影响 方法同上，实验分为对照组和实验组，对照组不加Ce6，实验组加入不同浓度Ce6，使Ce6终浓度分别为0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL，加入Ce6后每组分别孵育1h、2h、4h、8h、12h和24h，弃培养基并用PBS清洗，加入完全培养基继续培养24h，MTT法检测细胞存活率．

1．2．2 光照结合不同浓度Ce6对Eca—109细胞增殖的影响 方法同上，实验分为对照组、单纯光照组和光照结合不同浓度Ce6组，对照组不经任何处理，单纯光照组用5J／cm2光照处理，光照结合不同浓度Ce6组在加入Ce6后（Ce6终浓度分别为0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL）每组分别孵育1、2、4、8、12和24h，弃培养基并用PBS清洗，并用5J／cm2的光照处理，加入完全培养基继续培养24h，MTT法检测细胞存活率．

1．2．3 光照结合不同浓度Ce6处理后不同时间对Eca—109增殖的影响 方法同上，实验分为对照组和实验组，对照组不经任何处理，实验组Ce6终浓度分别为0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL，分别孵育12h，弃培养基并用PBS清洗，并用5J／cm2的光照处理，处理后加入完全培养基继续培养2、4、8、12和24h，MTT法检测细胞存活率．

1．2．4 不同光照剂量结合Ce6对Eca—109细胞增殖的影响 方法同上，实验分为对照组和实验组，对照组不经任何处理，实验组Ce6终浓度分别为0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL，分别孵育12h，弃培养基并用PBS清洗，分别用2．5，5，7．5，10和12．5J／cm2的光照处理，处理后加入完全培养基继续培养24h，MTT法检测细胞存活率．

1．2．5 划痕实验检测光照结合Ce6对Eca—109细胞迁移能力的影响 调整细胞浓度为3．2×104cells／mL，接种于96孔板，每孔200μL，置于培养箱中培养24h后，加入Ce6，使其终浓度分别为0．125、0．25和0．5ug／mL，继续孵育12h后吸去培养基，用无菌的10μL枪头划痕损伤后，PBS冲洗3次，采用5J／cm2光照处理，加入200μL无血清的培养基继续培养24h后拍照．对照组不做光照处理，实验中每组设5个复孔，重复3次．

1．3 数据分析

实验数据从3次独立的重复实验获得，采用SPSS 16．0软件（SPSS Inc．，Chicago，USA）进行处理，数据以±s．E．M表示，并采用单因素方差（ANOVA）分析及Student’s t－检验分析显著性差异．

2 结果

2．1 不同浓度Ce6对食管癌Eca—109细胞增殖的影响

实验结果如图1所示，不同Ce6浓度组（0．125、0．25和0．5μg／mL）在孵育不同时间（1、2、4、8、12、24h）与对照组相比差异无统计学意义（P＞0．05），而Ce6浓度为1．0μg／mL时，孵育至4、12h和24 h时，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05），说明低浓度的Ce6对Eca—109细胞的增殖无影响，高浓度的Ce6对细胞的增殖有抑制作用．

图1 Ce6作用后食管癌细胞Eca—109的存活率Fig．1 The concentration effect of chlorin e6 on cell survival rate of Eca—109

2．2 光照结合不同浓度Ce6对Eca—109细胞增殖的影响

实验结果如图2所示，单纯光照组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）；孵育4h后，0．125 μg／mL Ce6联合光照组与对照组相比具有显著性差异（P＜0．05），较高浓度的Ce6（0．25μg／mL、0．5 μg／mL和1．0μg／mL）联合光照处理后对细胞的增殖抑制作用更为明显（P＜0．01）；孵育8h后，不同Ce6组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）；说明单纯光对细胞的增殖无影响，Ce6－PDT能抑制Eca—109细胞的增殖，并且随着孵育时间的增加，细胞的生存率降低，Ce6－PDT对Eca—109细胞增殖的抑制作用增强，在共同孵育12h时对细胞增殖的抑制作用最大，到达平台期．

当给予5J／cm2的光照处理与无光组比较，光照条件下Eca—109细胞的存活率明显低于无光照组，如当Ce6终浓度为0．5μg／mL，与细胞孵育12h，无光条件下Eca—109细胞的存活率是96．71%，而Ce6－PDT后Eca—109细胞的存活率为57．44%，Ce6－PDT能有效的抑制Eca—109的增殖．

图2 孵育时间对Eca—109细胞增殖的影响Fig．2 Effects of incubation time on cell proliferation of Eca—109

2．3 光照结合不同浓度Ce6处理后不同时间对Eca—109增殖的影响

实验结果如图3所示，0．125μg／mL Ce6－PDT对细胞的增殖影响较小，在作用后的4h起表现出明显的抑制作用（与对照组相比，P＜0．05），而随着时间的延长，其抑制作用没有明显的变化；0．25μg／mL Ce6－PDT同样是在作用后4h起对细胞的增殖具有一定的抑制作用（与对照组相比，P＜0．05），且随着时间的延长，抑制的作用增强（与对照组相比，P＜0．01）；较高浓度的Ce6（0．5μg／mL和1．0μg／mL）在PDT作用后的2h时的细胞存活率与对照组相比有显著性差异（P＜0．05），并随着时间的延长（4、8、12h及24h）表现出明显的时间依赖性（与对照组相比，P＜0．01）．说明在一定的Ce6浓度下，随着处理后作用时间的增加，Eca—109细胞的相对存活率降低，Ce6－PDT对Eca—109增殖的抑制作用增强，具有作用时间依赖性．

图3 作用时间对Eca—109细胞增殖的影响Fig．3 Effects of interaction time on cell proliferation of Eca—109

2．4 不同光照剂量结合Ce6对Eca—109细胞增殖的影响

实验结果如图4所示，较低的光照剂量（2．5J／cm2）联合较低剂量的Ce6（0．125μg／mL和0．25 μg／mL）对细胞增殖的抑制作用不显著（P＞0．05），而与较高浓度的Ce6（0．5μg／mL和1．0μg／mL）联合作用时则表现出较为明显的抑制细胞增殖的效应（P＜0．05）；较高的光照剂量组（5、7．5、10和12．5 J／cm2）与无光组比较差异有统计学意义（P＜0．05），Ce6－PDT对Eca—109的增殖的抑制作用具有光照剂量依赖性，光照剂量为10和12．5J／cm2都能明显的抑制细胞的增殖，但是抑制作用相差不大，达到平台期．

图4 光照剂量对Eca—109增殖的影响Fig．4 Effects of irradiation doses on cell proliferation of Eca—109

2．5 划痕实验检测光照结合Ce6对Eca—109细胞迁移能力影响

划痕实验检测结果如图5所示，正常对照组和单纯光照组细胞划痕宽带较小（图5A，5E）；单纯Ce6组，随着Ce6浓度增加，划痕的宽度在逐渐增加（图5B、C、D），当Ce6浓度为0．5μg／mL时划痕宽度最大，细胞几乎没有迁移到划痕处（图5D）；光照结合0．125μg／mLCe6处理后（图5F），与对照组相比，划痕宽度较大，但当Ce6浓度增大到0．25和0．5μg／mL时（图5G、H），与对照组和单纯光照组相比，划痕宽度差异明显，与单纯Ce6处理组相比，划痕宽度变化并不明显．

图5 不同浓度的Ce6－PDT对Eca—109细胞迁移的影响Fig．5 Effect of Ce6－PDT with different concentration on cells migration of Eca—109

3 讨论

从MTT法检测细胞增殖实验结果来看，在Eca—109细胞水平上单纯的光照对细胞的增殖没有影响，低浓度的Ce6（低于0．5μg／mL）对细胞的增殖无明显作用，但当Ce6增大到1．0μg／mL，表现出对Eca—109细胞增殖的抑制．龙朝钦［5］等通过Ce6－PDT对黑素瘤A—375细胞研究得出Ce6－PDT能有效的杀伤体外培养的人黑素瘤A—375细胞，得出的结论与本实验一致，对于原因其认为可能是Ce6在肿瘤选择性方面存在局限与其治疗剂量对正常细胞的毒性有关．但Sheleg等用Ce6－PDT应用于临床治疗恶性黑色素瘤取得了良好的效果，并未发现明显的Ce6的系统毒性［6］．对于两者报道的差异，仍需要深入研究，相关研究也报道了Ce6对肿瘤的治疗中优越性［7－8］．Ce6－PDT能有效抑制Eca—109细胞的增殖，存在Ce6浓度、孵育时间、作用时间和光照剂量的依赖性，并且在一定程度内，其抑制作用随着Ce6浓度、光照剂量和孵育时间的增加增强，但对增殖的抑制作用均存在平台期，并不是光敏剂用量越多、光照剂量越高、孵育时间和作用时间越长对细胞的增殖抑制效果越明显，如光照剂量为10J／cm2和12．5J／cm2都能明显的抑制细胞的增殖，但是抑制作用相比差异不显著，原因可能是细胞对光敏剂的吸收代谢及过高光照剂量导致缺氧限制了PDT的效果［9－10］．提示在Ce6－PDT治疗过程中，合适的PDT参数对治疗的重要性．

浸润转移是肿瘤最基本的生物学特征，也是引起肿瘤患者死亡的主要原因之一，肿瘤的定向迁移是肿瘤转移的关键，在通过划痕实验检测Ce6－PDT对细胞迁移能力影响的研究中，低浓度Ce6（低于0．125μg／mL）光动力对细胞的迁移作用明显；但Ce6浓度继续增大到0．5μg／mL，Ce6－PDT组与单纯Ce6组划痕宽度比较差异不明显，Ce6－PDT对Eca—109细胞迁移无明显作用．目前关于对食管癌迁移机制的报道比较多，如Verma等［11］分析食管癌中活化白细胞黏附分子（Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule，ALCAM）的表达水平，发现85%食管癌和67%不典型增生中ALCAM高表达，与食管癌的转移高度相关．在食管癌的迁移过程中Ezdin骨架蛋白、特异性DNA甲基转移酶（DNA ethyltransferase，DNMT）、CD97、JWA基因和Snail基因等诸多因素都被报道与之相关［12－16］．但对于Ce6如何影响Eca—109细胞迁移，目前还不清楚．

4 结论

本试验结果显示，光照结合二氢卟吩e6可以对食管癌Eca—109细胞产生一定的细胞增值抑制，并且对其迁移能力也有一定的影响，但关于Ce6－PDT对食管癌的增殖和迁移的具体机制还不是十分清楚，仍需进一步研究．

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