八角莲活性成分鉴别及其抗癌活性研究

张艳君,冯 川

(沈阳药科大学医疗器械学校,辽宁 沈阳 117004)

·论 著·

八角莲活性成分鉴别及其抗癌活性研究

张艳君,冯 川

(沈阳药科大学医疗器械学校,辽宁 沈阳 117004)

目的对八角莲化合物进行分离和鉴别，测定八角莲成分的抗癌活性。方法采用渗漉、萃取、层析、色谱等方法提取、分离、鉴别化合物，采用MTT法测定鬼臼毒素的抗癌活性。结果从中分离得到3个化合物。并运用质谱、核磁共振色谱等手段对化合物结构进行解析，最终确定化合物为4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角莲醇和鬼臼毒素。MTT 法检测结果显示，不同浓度的鬼臼毒素处理SGC7901细胞24，48和72 h后，鬼臼毒素呈时间与剂量依赖性抑制SGC 7901胃癌细胞生长。结论八角莲含有4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角莲醇和鬼臼毒素等化合物，其具有SGC7901细胞增殖抑制作用。

八角莲;鬼臼毒素;SGC7901细胞增殖抑制

1 材料与方法

1.1仪器和试剂

Bruker AV 400 MHz超导核磁共振仪;Varian prostar制备型高效液相色谱仪，CO-150型二氧化碳培养箱(美国NBS公司),Sephadex LH-20柱层析凝胶(Pharmacia公司),DMSO(美国amresco公司),DMSO、MTT(美国Sigma公司),胎牛血清(Gibco公司)，RPMI 1640培养基(Hyclon公司)。

1.2试药和细胞

鬼臼毒素，自制，配成相应溶液备用。胃癌SGC 7901细胞株由中国医科大学提供。

1.3提取和分离

八角莲原药材10 kg，粉碎成粗粉，用10倍量的80%乙醇渗漉提取3次，每次24 h，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩，得到总浸膏。浸膏用适量水溶解后分别用醋酸乙酯和正丁醇萃取，得到醋酸乙酯部分、正丁醇部分及水溶性部分。分别回收溶剂，取醋酸乙酯部分，采用了硅胶柱层析、反相中低压层析、柱层析和HPLC等分离纯化技术，从中分离得到3个化合物。

1.4鬼臼毒素抗癌活性

1.4.1细胞培养

胃癌SGC 7901细胞按常规培养在含有10%小牛血清的培养液(每100 mL含90 mL DMEM、10 mL小牛血清、0.1 g青霉素、0.1 g链霉素)中，于37 ℃，5% CO2，相对湿度为98%的培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，待长至80%～90%细胞发生融合时，用含0.25%胰酶消化细胞传代培养，收集对数生长期细胞用于实验。

1.4.2MTT法检测细胞生长

将对数生长期的人SGC 7901细胞悬液调整为5×104/L，接种于96孔培养板，每孔100 μL，实验组分别加入3种不同浓度鬼臼毒素(5、10、20 mg/L)，对照组不加药，每组设4个复孔，37 ℃，5% CO2培养箱中培养，于24、48、72 h后每孔加入MTT 20 μL。继续培养4 h，小心弃去孔内培养液,加入150 μL DMSO,振荡10 min,用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处的吸光度(A490)值，按下式计算细胞抑制率。

抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%

1.5统计方法

采用SPSS13.0统计学软件进行分析，各组间指标的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1化合物结构鉴定

化合物1黄色粉末，mp 219-221℃。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.46(1H，d，J=3.2HZ)，2.89(2H，dd，J=3.2，1.6 HZ)，2.69(3H，m)，4.59(4H，d，J=10.8 HZ)，7.12(5H，s)，6.45(8H，s)，4.53-62(11H，m)，6.56(1′H，J=2.2 HZ)，6.12(6′H，d，J=2.2 HZ)，3.66(OCH3)，5.93(OCH2O);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：45.3(C1)，46.5(C2)，41.5(C3)，73.5(C4)，107.5(C5)，147.6(C6)，147.3(C7)，111.1(C8)，133.4(C9)，135.7(C10)，72.5(C11)，176.3(C12)，133.1(C1′)，107.5(C2′)，147.3(C3′)，134.3(C4′)，147.6(C5′)，112.3(C6′)，56.9(OCH3)，102.8(OCH2O)。

以上数据与文献报道的4′,5′-二去甲基鬼臼毒素[5]一致,故确认为4′,5′-二去甲基鬼臼毒素(图1)。

化合物2白色无定形粉末。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.92(2-H，s)，6.76(4-H，s)，6.78(6-H，s)，4.56(7-H，d，J=8.1 HZ)，2.66(8-H，m)，4.46(9α-H，dd，J=8.1，8.3 HZ)，4.76(9β-H，dd，J=4.5，8.5 HZ)，6.98(2′-H，d，J=3.1HZ)，6.76(5′-H，d，J=1.6 HZ)，6.86(6′-H，dd，J=1.5，8.1 HZ)，4.56(7′-H，d，J=7.8 HZ)，2.24(8′-H，m)，3.76(9′α-H，dd，J=5.1，11.2 HZ)，3.69(9′β-H，m)，3.86(3-OCH3，s)，3.86(3′-OCH3，s);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：134.5(C1)，109.8(C2)，145.5(C3)，114.3(C4)，147.5(C5)，119.6(C6)，75.6(C7)，51.1(C8)，69.4(C9)，132.7(C1′)，109.5(C2′)，147.3(C3′)，145.1(C4′)，114.5(C5′)，118.3(C6′)，83.3(C7′)，51.6(C8′)，61.3(C9′)，54.9(5-OCH3)，54.8(3′-OCH3)。

以上数据与文献报道的八角莲醇[6]一致,故确认为八角莲醇(图2)。

化合物3白色晶体，mp 158-161℃，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.76(1H，d，J=3.1 HZ)，2.97(2H，dd，J=3.2，1.5 HZ)，2.71(3H，m)，4.65(4H，d，J=8.8 HZ)，7.12(5H，s)，6.44(8H，s)，4.51-4.63(11H，m)，6.46(1′H，s)，6.42(6′H，s)，3.71(3′-OCH3，s)，3.72(4′-OCH3，s)，3.73(5′-OCH3，s)，5.93(OCH2O);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：45.4(C1)，46.3(C2)，41.9(C3)，73.2(C4)，107.2(C5)，148.9(C6)，148.6(C7)，110.3(C8)，135.6(C9)，132.4(C10)，72.6(C11)，177.3(C12)，138.1(C1′)，109.5(C2′)，153.3(C3′)，138.3(C4′)，153.6(C5′)，109.3(C6′)，56.9(3′-OCH3)，61.5(4′-OCH3)，56.9(5′-OCH3)，102.8(OCH2O)。

以上数据与文献报道的鬼臼毒素[7-8]一致,故确认为鬼臼毒素(图3)。

图 1 4′,5′-二去甲基鬼臼毒素 图 2 八角莲醇 图 3 鬼臼毒素

2.2MTT比色法检测结果

不同浓度的鬼臼毒素处理SGC7901细胞24、48和72 h后,鬼臼毒素呈时间与剂量依赖性抑制SGC 7901胃癌细胞生长。低浓度的鬼臼毒素便对SGC7901细胞增殖具有抑制作用，20 mg/L的高剂量组鬼臼毒素抑制作用更显著，72 h后抑制率达到67.79%。

表 1 鬼臼毒素对SGC7901细胞增殖的影响(%)

与对照组相比较，*P<0.05,**P<0.01

3 讨 论

鬼臼类植物是一类含有显著生物活性物质的药用植物,因为其作用显著，所以具有悠久的应用历史。历来医家均有应用鬼臼类植物诊治疾病的记载，临床上主要用于蛇咬伤、痈疖肿毒、跌打损伤、风湿筋骨痛及气管炎等症[9-11]。

本研究对八角莲植物的根及根茎进行化合物的提取分离及鉴别。用10倍量的80%乙醇渗漉提取，回收溶剂后，将浸膏用适量水溶解后分别用醋酸乙酯和正丁醇萃取，醋酸乙酯部分采用了硅胶柱层析、反相中低压层析、柱层析和HPLC等分离纯化技术，从中分离得到3个化合物。并运用质谱、核磁共振色谱等手段对化合物结构进行解析，最终确定化合物为4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角莲醇和鬼臼毒素。

为探讨鬼臼毒素的抗癌活性，本研究以胃癌细胞株SGC-7901细胞为目标细胞，通过自制鬼臼毒素，考察了不同浓度的鬼臼毒素对胃癌细胞生长的抑制作用，探讨鬼臼毒素是否具有诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用。MTT法检测结果显示，不同浓度的鬼臼毒素处理SGC7901细胞24、48和72 h后,鬼臼毒素呈时间与剂量依赖性抑制SGC 7901胃癌细胞生长。低浓度的鬼臼毒素便对SGC7901细胞增殖具有抑制作用，20 mg/L的高剂量组鬼臼毒素抑制作用更显著，72 h后抑制率达到67.79%。

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Theidentificationoftheactivecomponentofdysosmaversipellisanditseffectonanticanceractivity

ZHANG Yan-jun,FENG Chuan

(School of Medical Devices Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang，Liaoning Province,117004，China)

ObjectiveTo isolate and identify the active component of dysosma versipellis and determine its anticancer activity.MethodsThe percolation，solvent extraction，chromatography and gas chromatography were used to extract and identify the compound and MTT were applied to determine the anticancer activity of podophyllotoxin.ResultsThree compounds are isolated.Mass spectroscopy and nuclear magnetic resonance chromatography were made to analysis the compound structure，which confirmed as 4′,5′-didemethylpodophyllotoxin，dysosmarol and podophyllotoxin.The MTT shows that the proliferation of SGC7901 gastric cancer cells could be inhibited by the podophyllotoxin of different dose at 24，48 and 72 h in the time and dose-dependent manner.ConclusionDysosma versipellis contains the compounds such as 4′,5′-didemethylpodophyllotoxin，dysosmarol and podophyllotoxin， it own inhibitory effect on proliferation of SGC7901.

dysosma versipellis;podophyllotoxin;inhibition of cell proliferation SGC7901

1673-2995(2013)04-0241-04

R284

A

张艳君(1963-)，女(汉族)，工程师，本科.

2013-04-19)

八角莲为小檗科(Berberidaceae)八角莲属(Dysosma)植物八角莲[Dysosma versipellis (Hance) M.Cheng]的干燥根及根茎，八角莲性凉，味甘、微苦，有毒，具有清热解毒、活血散瘀的功能[1-2]。现代药理研究表明，八角莲具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用[3-4]。其中，鬼臼毒素(podophyllotoxin)类化合物的抗肿瘤作用受到国内外学者的广泛关注。本实验对八角莲药材进行提取分离纯化，对得到的化合物进行结构确证，同时探讨鬼臼毒素的抗癌活性。