淫羊藿苷CaCO3纳米微球在大鼠体内的血药浓度监测

王安斌，李群芳，牟方涛，周旭美

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

淫羊藿苷CaCO3纳米微球在大鼠体内的血药浓度监测

王安斌，李群芳，牟方涛，周旭美

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

目的HPLC法监测淫羊藿苷CaCO3纳米微球血药浓度，以评价其在大鼠体内缓释效果。方法采用HPLC法测定大鼠灌胃淫羊藿苷CaCO3纳米微球后不同时间点大鼠血药浓度。结果大鼠灌胃200 mg/kg淫羊藿苷CaCO3纳米微球后30 min可检测到Ica， 60 min后淫羊藿苷开始大量释放，80 min后释放速度减慢，表明Ica/CaCO3在大鼠体内具有良好的缓释性能。结论淫羊藿苷以多孔空心纳米微球碳酸钙作为载体，在大鼠体内能够达到良好的缓释效果。

淫羊藿苷; CaCO3空心纳米微球; 血药浓度; 缓释效果

纳米药物，是运用纳米化制备技术制备出的一类新型药物，它与传统药物相比具有更高的生物利用度，更好的靶向性，溶解性，缓控释性等优点[1]。纳米药物可有效提高药效，降低不良反应，已经成为现今国际医学领域的前沿和热点[2]。

碳酸钙纳米材料属于纳米氧化物，粒径在10～100 nm，具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒并且降解速率适宜，在生物学和医药界中被广泛的应用[3]，曾有报道利用CaCO3作为载体包载布诺芬(BU)，载药量可以达到130 mg/g。药物释放100%时持续释放药物的时间可达40 h[4]。本课题组通过实验发现将Ica包载到CaCO3发现载药率可以达到45%[5]。体外释放实验发现释药时间可持续释放30多小时，证实体外有缓慢释放的效果。那么在体内是否也能有缓释的效果？本实验通过将自制的Ica/CaCO3纳米微球对大鼠灌胃，HPLC测定不同时间点大鼠血液中Ica的浓度，与文献灌胃原型药物Ica后，Ica的血药浓度达峰时间进行比较[6]，以评价Ica/CaCO3纳米微球在大鼠体内的释放情况。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent-1100高效液相色谱仪(Agilent Technologies Co. Ltd)；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；PH酸度计(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)；Ica/CaCO3空心微球由实验室自制[6], 粒径由透射电镜测定约为1 μm。

淫羊藿苷标准品(中国药品生物制品检定所，含量：>98%，批号：110737-200415)；无水氯化钙(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；十二烷基硫酸钠(分析纯，成都化学试剂厂)；碳酸钠(分析纯，重庆西部化学试剂厂)；乙腈(色谱纯)；无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均为分析纯；去离子水。

1.2 动物 Wister大鼠，雌雄不限，体重(400±20)g，遵义医学院实验动物中心购买，动物自由摄食自来水和普通饲料。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent-EclipseXDB-C18色谱柱(250×4.6 mm, 5 μm)；检测波长：270 nm；流动相：乙腈-水(30∶70)；流速：1.0 mL·min-1，柱温：25 ℃[7]。

1.3.2 对照品的制备 精密称取4.8 mg的淫羊藿苷，置于50 mL的容量瓶中，用甲醇进行溶解，定容至刻度得到0.096 mg/mL的溶液。

1.3.3 对大鼠灌胃后进行颈静脉插管取血 取Wister大鼠12只，取自由饮水条件下，禁食12 h。随机分两组，一组按含200 mg/kg灌胃Ica/CaCO3，另一组做空白。将灌胃好的大鼠，腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，将大鼠固定于手术台上，保持其体温为37 ℃，将颈部一侧锁骨上方皮肤做2 cm的纵切口，暴露并分离颈静脉用常规插管法插入18 cm 长内含生理盐水的硅胶管(医用管，内径0.02 mm，外径0.037 mm ,USA)，检查血流通畅后，进行固定。于给药后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min、120 min取血，每次取血0.5 mL于2 mL预先肝素化的离心管中，离心取上层血浆于2 mL的离心管中，-20 ℃低温保存，备用。

1.3.4 血浆样品处理办法

1.3.4.1 空白血浆及含药血浆样品处理 取血浆样品0.2 mL于2 mL的离心管中，加入1.75 mL乙酸乙酯，振荡3 min后离心(2 000 r/min时间：5 min)，取上清液，50 ℃水浴N2吹干，用流动相乙腈-水(30∶70)200 μL溶解，再以0.45 μm微孔滤膜过滤即可。

1.3.4.2 空白血浆加对照品样品处理 精密吸取一定体积的对照品溶液，常温下用N2吹干后精密加入0.2 mL空白血浆，振荡3 min，加入1.75 mL乙酸乙酯，振荡3 min后离心(2 000 r/min时间：5 min)，取上清液，50 ℃水浴N2吹干，用流动相乙腈-水(30∶70)200 μL溶解，再以0.45 μm微孔滤膜过滤即为空白血浆加对照品溶液。

2 结果

2.1 HPLC分析方法认证

2.1.1 系统适用性实验 分别取空白血浆、空白血浆加Ica标准品及Ica/CaCO3灌喂大鼠后的血浆各20 μL，进样，同时取一份淫羊藿苷对照品20 μL进样。结果(见图1A-D)。试验发现发现对照品d图中Ica的保留时间为6.703 min。Ica加入空白血浆后及灌胃Ica/CaCO3的大鼠血浆色谱图响应位置上，有相同保留时间的色谱峰(见图1B,C)，且空白血浆样品无干扰。

2.1.2 标准曲线制备 按“1.3.4.2”项下方法操作6份含不同浓度对照品的空白血浆溶液，20 μL进样分析。以各对照品溶液浓度为横坐标，对照品色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，得回归方程为：y=19478x-5.0312(mg/mL，r=0.9997)，线性范围为0.004 8～0.057 6 mg/mL。

注：A:空白血浆;B:空白血浆加Ica;C:灌喂大鼠Ica/CaCO3供试品溶液;D:对照品Ica。 图1 HPLC色谱图

2.1.3 精密度实验 取Ica浓度为0.038 4 mg/mL的空白血浆溶液，重复进样6 次, 注入液相色谱仪，测定峰面积，计算相对标准偏差(RSD)，测得RSD 为1.20 %，结果表明仪器精密度良好，测定结果(见表1)。

表1精密度试验

2.1.4 稳定性试验 取“2.1.3”项下制备空白血浆加对照品溶液，连续进样6次，每次间隔1 h，取样后将样品置于4 ℃冰箱保存。测得的Ica峰面积RSD为1.87 %，结果表明对照品的空白血浆样品溶液在6 h内稳定。

2.1.5 回收率试验 按“1.3.4.2”项下方法操作，制备淫羊藿苷0.0960mg/mL、0.0192mg/mL、0.0384 mg/mL样品溶液各6份，进样分析得样品峰面积A1，标准曲线法计算浓度，所得浓度与实际浓度的比值即为方法回收率；另取纯净水0.2 mL取代血浆，按“2.4.2”项下方法操作，得到与样品相同质量浓度的标准工资液，进样分析得峰面积A2，计算对照品峰面积与标准工作液峰面积的比值(A1/A2)，即为提取回收率。结果淫羊藿苷的方法回收率为101.31%、98.90%、95.64%，平均回收率为98.62%，RSD为2.17%；提取回收率为98.37%、102.45%、101.27%，平均回收率为100.70%，RSD为1.93%。

2.2 对不同时间点的血浆样品进行HPLC检测 将Wister大鼠灌胃后取出的不同时间点的血浆样品，按照血浆样品的处理方法处理后得到不同时间点10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min、120 min的样品，按照上述色谱条件，取20 μL进行进样分析。根据标准曲线计算出各个时间点峰面积所对应的淫羊藿苷浓度(mg/mL)。并用时间-血药浓度来作图，可得到药时曲线(见图2)。

图2 血药浓度的变化曲线

3 讨论

本文通过实验，建立了HPLC测定Ica/ CaCO3纳米微球的血药浓度方法，结果表明，该方法准确、灵敏，能满足生物样品分析要求，可用于Ica/ CaCO3纳米微球的血药浓度监测。

在不同时间点对大鼠灌胃后Ica/ CaCO3纳米微球的血药浓度监测中发现，大鼠经灌胃后30 min中后可监测到Ica，其后Ica量持续增加，60 min后Ica释放速率迅速增大，灌胃80 min后释放速率减缓。从释放曲线可看出CaCO3包裹的Ica释放可分成两个阶段：第一阶段为最初60 min，这个时期Ica药物呈相对平稳、缓慢的释放，由于它的释放要通过CaCO3, 所以释放比较缓慢；第二阶段为60～120 min，这一时期， CaCO3少量溶解，使CaCO3空心微球空隙增大，Ica 大量释放。而叶丽卡等[6]曾报道淫羊藿苷在大鼠体内经灌药后血药浓度在30 min就达到了最大，此后进入消除阶段。比较灌胃Ica/ CaCO3纳米微球与直接灌胃Ica，发现灌胃Ica/ CaCO3纳米微球后，发现达到最大血药浓度的时间延长，可以让药物长时间的维持在一个较高的浓度范围，同时证明CaCO3空心微球作为药物载体时能明显地延长药物释放时间。

通过对Ica/CaCO3纳米微球在大鼠体内的血药浓度监测的研究，证明该纳米制剂可进入体内循环，为Ica/CaCO3纳米微球在大鼠体内的全面药代动力学研究提供了实验依据。

[1] 杨祥良,徐辉碧,廖明阳,等.纳米药物安全性[M].北京：科技出版社，2009.

[2]Rosen H,Abribat T.The rise and rise of drug delivery [J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(5):381-385.

[3]李苏,姜文奇,王安训,等.5-FU核壳共聚物纳米胶束的制备及其体内释放的研究[J].癌症,2004,23(4):381-385.

[4]李亮,朱英杰,曹少文,等.碳酸钙纳米结构多孔空心微球的制备及其药物缓释性能研究[J].无机材料学报,2009,24(1):166-170.

[5]李群芳,冯学永,牟方涛,等.淫羊藿苷的CaCO3微球制备及药物释放性能研究[J].遵义医学院学报,2012，35(4):279-282.

[6]叶丽卡,陈济民,刘四海，等.淫羊藿苷在大鼠体内的药代动力学[J].中国药学杂志,1999,34(1):33-36.

[7]郑传痴,娄方明,陈桂华,等.正交试验优选微波辅助提取淫羊藿中淫羊藿苷的工艺[J].中国药房,2010,21(31):2907-2908.

[收稿2013-08-27;修回2013-09-26]

(编辑：谭秀荣)

MonitoringofbloodconcentrationofNanoparticlespreparationincludingIcariinandCaCO3inrats

Wanganbin,Liqunfang,Mufangtao,Zhouxumei

(School of Pharmacy，Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo monitor the blood concentration of icariin CaCO3nanospheres by HPLC and evaluate its prolonged-release efficiency in rats.MethodsThe rats were intragastric administered with icariin CaCO3nanospheres. The blood concentration of different time points were tested by established HPLC.Resultsthe blood concentration of icariin CaCO3appeared at 30 min,released large quantity of Ica after 60 min and released slowly after 80 min, which showed that the Ica/CaCO3has a good sustained-release performance in rats.Conclusionporous hollow nanospheres calcium carbonate is the good carrier for Icariin, which can reach a good sustained release effect.

Icariin; Nano-structured Microspheres;blood concentration, prolonged-realease effect

贵州省科学技术基金项目(NO:黔科合J字[2010]2214)。

李群芳，女，副教授，硕士生导师，研究方向：药物分析相关研究，E-mail:slindar809 @126.com。

R927.1

A

1000-2715(2013)06-0525-03