小鼠原发性肝癌中胰岛素样生长因子2和H19的表达及意义

文国容，金 海，徐尚福，杨 媛，计 蓓，周 姝，陈 萍，庹必光

(1.遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099; 2.遵义医学院 药理学教研室,贵州 遵义 563099；3.贵阳医学院肿瘤医院 药剂科，贵州 贵阳 550001)

小鼠原发性肝癌中胰岛素样生长因子2和H19的表达及意义

文国容1，金 海1，徐尚福2，杨 媛1，计 蓓1，周 姝1，陈 萍3，庹必光1

(1.遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099; 2.遵义医学院 药理学教研室,贵州 遵义 563099；3.贵阳医学院肿瘤医院 药剂科，贵州 贵阳 550001)

目的观察IGF2、H19在原发性肝癌中的表达并了解其意义。方法建立原发性肝癌模型，模型建立后第20周处死小鼠取肝癌及癌旁组织储存于-80 ℃备用，另取正常小鼠肝脏作对照，用Real time RT-PCR方法检测IGF2、H19 mRNA的变化。结果与对照组比较，IGF2、H19在癌旁及癌组织中的表达都显著增加，在癌组织中增加更为显著P<0.05。结论IGF2、H19的异常变化与小鼠原发性肝癌的发生发展有关。

胰岛素样生长因子2；H19； 小鼠；原发性肝癌

近年来基因印迹和肿 瘤发生发展的关系逐渐受到人们的关注，在某些病理情况下，处于印迹状态的基因也可重新表达，引起一系列的病理生理改变。 印迹基因H19和胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor, IGF2 )是较早被发现的印迹基因，它们的基因印迹与原发性肝癌的关系怎样，目前研究较少，我们希望通过检测原发性肝癌中H19和 IGF2基因的印迹改变，了解印迹基因H19和IGF2与肝癌的关系，探讨小鼠原发性肝癌中H19和IGF2的印迹调控，为肝癌的治疗及预后提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器 二甲基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine， DEN)(Sigma 公司)、四氯化碳(天津市协和吴鹏色谱科技有限公司)、胰岛素样生长因子2 和 H19及内参β-actin引物(TaKaRa生物工程公司)、cDNA逆转录试剂盒及RNA扩增试剂盒(TaKaRa生物工程公司)、实时荧光定量PCR仪(美国 BIO-RAD公司)、全波段酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 实验动物 SPF级C57BL/6J雄鼠，4周龄，体重18～22 g，购自重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心。动物许可证号：SCXK(渝)2012-0001。 自由饮水进食，动物房室温维持在23 ℃左右，适应性饲养一周后进行肝癌造模。

1.3 肝癌模型制备及取材 模型制备参考文献[1]，取30只小鼠，每只小鼠一次性腹腔注射DEN (100 mg/kg)，3 d后灌胃CCl4(橄榄油配制，浓度为20%)，0.05 mL 10 g，2次/周，14 d再次腹腔注射DEN (50 mg/kg)，同时开始每天给予含有9%乙醇的饮用水，第4周开始加大CCl4剂量至0.08 mL 10 g，直至造模结束。另取20只小鼠作为正常对照，不造模，仅自由饮用灭菌普通水。于20周后处死动物取癌组织、癌旁组织及正常肝组织储存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 Real-Time RT-PCR检测基因的表达 取50～100 mg的正常肝组织、癌旁组织、癌组织分别置于1 mL Trizol中匀浆，加入200 μL的氯仿，震荡混匀，12 000 g/min，4 ℃离心15 min。吸取上清300 μL转入另外去酶EP管中，加等量异丙醇混匀后，12 000 g/min，4 ℃离心10 min，弃去上清，在沉淀加入无RNA酶的75%乙醇洗涤两次，每次12 000 g/min，4 ℃离心2 min,去上清液 ，待其干燥后加入50 μL DEPC水溶解RNA,用全波段酶标仪检测其纯度和浓度。取200 ngRNA按试剂盒说明配成20 μL体系逆转录，然后按照扩增试剂盒说明配制20 μL扩增体系，PCR反应条件为：第1步：95 ℃×5 min，第2步：95 ℃×30 s，60 ℃×1 min，循环40次，第3步：65 ℃×30 s，循环61次。目的基因的相对表达量以“目的基因/内参基因”表示。引物序列(见表1)。

表1 Real-Time RT-PCR引物序列

Gene Forwardprimer ReverseprimerIGF-IIAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTTTGCTGGACATCTCCGAAGAGH19CCACCCACTCACTCAGGATTGGGCAGAAGAGAACTCACCTβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA

2 结果

2.1 大体形态学观察 正常肝脏颜色红润，表面光滑；肝癌模型组可见肝体积增大，表面有大小不等的结节(见图1)。

注：A:正常肝脏;B:肝癌肝脏。 图1 正常肝脏及肝癌肝脏大体图片

2.2 组织形态学观察 正常肝组织中央静脉清楚，细胞大小均匀，形态一致；肝癌组织则正常组织结构消失，细胞大小不等，形态多样，核大深染，核分裂像多见，并见病理性核分裂(见图2)。

注：A:正常肝组织 (HE×200);B:肝癌组织(HE×200)。 图2 正常肝组织及肝癌组织HE染色

2.3 RT-PCR检测IGF2、H19 mRNA的表达 与正常对照组比较，IGF2在癌旁及癌组织中的表达均明显上调，分别为正常组织的4.7倍和19倍(P<0.05)。H19癌旁组织中RNA的表达是正常组织的8.8倍，而癌组织是正常组织的32.8(P<0.05,见图3、图4)。

3 讨论

基因印迹又称基因组印迹或者配子印迹，H19、IGF2 印迹基因隶属于同一个基因印迹群，分别位于人染色体11P15.5，鼠7 号染色体，在进化上具有高度保守性[2]。有研究发现，印迹异常是一些恶性肿瘤重要的分子生物学特征，也是发生癌变的重要因素之一。

Yoshimizu 等[3]用小鼠模型研究发现H19 基因位点在肿瘤的发生发展以及肿瘤的大小、数量等方面发挥重要的调节作用，这也是首次有人提出H19基因在体内具有抑制肿瘤作用， 但Matouk 等[4]则认为 H19 是人源肿瘤生长所必需的， Ariel 等[5]认为 H19 基因是人膀胱癌早期复发的一个标志物。本研究发现，H19在小鼠正常组织中表达甚微，在癌旁组织及癌组织中均有表达，且在癌组织中高表达，但在癌组织中的表达是癌旁的四倍，该结果显示，在肝癌组织中H19印迹上调，且在癌症发生早期就发生改变，是否可作为其诊断的分子生物学标志尚需更多的实验结果加以证实。

基因组印迹是目前肿瘤医学领域研究的热点，随着分子生物学及表观遗传学的研究进展，肿瘤与IGF2印迹基因的表达备受关注[6]。胰岛素样生长因子2(IGF2)是迄今所知功能最复杂的生长调控因子之一,它能促进细胞的有丝分裂和分化并参与出生后基因组重建，所有的这些功能说明IGF2在机体生长发育过程中的重要性[7]，但其促进有丝分裂过程是通过IGF2受体介导的，这是肿瘤细胞生长的一条重要通路，IGF2受体水平受阻可抑制肿瘤细胞生长。正常情况下，IGF2两个等位基因中一个因为印迹而沉默，另一个正常表达，如果印迹的等位基因发生杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)，导致双等位基因表达，基因产物成倍增加，其过度表达参与了肿瘤的发生[8]。

原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，同其他肿瘤一样，原发性肝癌的治疗效果取决于能否早期发现，以及恰当的、适合患者的“个体化”的治疗方案。近年来，基因印迹与肿瘤发生发展的关系逐渐受到人们重视，有人相继从卵巢癌、Wiim's瘤、骨肉瘤和大肠癌等多种肿瘤中发现IGF2和/ 或H19 的印迹异常[9-10]。我们的研究发现在小鼠原发性肝癌的癌旁组织中IGF2和H19表达开始增加，且癌组织增加更为显著，说明两者与肝癌的发生、发展有关，但IGF2和H19两者的变化是否有关联，调控机制与肿瘤发生，发展的关系怎样，尚需要我们更深入的研究，希望能通过对小鼠原发性肝癌印迹基因IGF2和H19的研究，找到肝癌早期发生的标志物，能为肝癌的预防及早期治疗奠定新的理论及实验基础。

[1] 匡志鹏,谢裕安,杨帆，等.C57BL/6J小鼠肝癌动物模型的建立[J].中国普通外科杂志,2007,16(7):657-660.

[2]张小刚,安利国,郑晓飞. H19基因研究进展[J].军事医学，2011,35(6):469-472.

[3]Yoshimizu T，Miroglio A，Ripoche M A，et al． The H19 locusacts in vivo as a tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(34):12417 -12422.

[4]Matouk I J，DeGroot N，Mezan S, et al.The H19 non- coding RNA is essential f or human tumor growth[J]. PLoS One，2007,2(9):845.

[5]ArielI，Sughayer M，Fellig Y，et al.The imprinted H19 (6):3 gene is a marker of early recurrence in human bladder carcinoma [J]．Mol Pathol,2000，53(6):5320-323.

[6]李云莉，梁元娇，吴元赭.子宫内膜癌胰岛素生长因子2的表达和印迹状态的改变[J].医学研究生学报，2012,25(6):605-608.

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[10]Uianer G A，Vu T H，Li T，et al. Loss of imprinting of IGF2 and H19 in osteosarcoma is accompanied by reciprocai methyiation changes of a CTCF-binding site[J]. Hum Moi Genet，2003,12(5):535-549.

EffectsofInsulin-likegrowthfactor2andH19inmousehepatocellularcarcinoma

Wenguorong1,Jinhai1,Xushangfu2,Yangyuan1,Jibei1,Zhoushu1,Chenping3,Tuobiguang1

(1.Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099，China; 2. Department of Pharmacology of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099，China; 3. Department of Pharmacy，Tumor Hospital of Guiyang Medical College,Guizhou Guiyang 550001，China)

ObjectiveTo investigate the effects of IGF2 and H19 in mouse hepatocellular carcinoma and discuss its functional mechanism.MethodsC57BL/6J mice were given diethyl nitrosamine (DEN) and CCl4 to induce hepatocellular carcinoma. At 20 weeks, normal liver tissue, DEN-treated peri-cancerous and cancer tissue were collected to isolated total RNA. Expression of IGF2 and H19 were examined by real-time RT-PCR.ResultsCompared to the control，the levels of IGF2 and H19 in model group were significantly increased (P<0.05).ConclusionIncreased expression of IGF2 and H19 is associated with the development of DEN-induced hepatocellular carcinoma in mice.

IGF2；H19；mice；Hepatocellular Carcinoma

国家自然科学基金项目(NO:81160054)。

庹必光，男，博士，教授，研究方向：消化系统肿瘤及离子通道转运，E-mail:tuobiguang@yahoo.com.cn。

R592

A

1000-2715(2013)05-0422-03

[收稿2013-07-23;修回2013-08-28]

(编辑：谭秀荣)