慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中树突状细胞的变化

饶习敏，欧阳瑶，顾延会

(遵义医学院附属医院 呼吸一科，贵州 遵义 563099)

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中树突状细胞的变化

饶习敏，欧阳瑶，顾延会

(遵义医学院附属医院 呼吸一科，贵州 遵义 563099)

目的了解慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织中的DCsmRNA表达变化。方法通过烟熏+脂多糖(LPS)方法建立COPD大鼠模型。HE染色观察气道及肺组织病理学的改变，同时用荧光定量RT-PCR检测CD86mRNA及OX-62mRNA在肺组织中的表达变化。结果COPD模型组大鼠肺组织HE染色符合慢性支气管炎及肺气肿的病理改变。与正常对照组相比，COPD模型组大鼠CD86mRNA及OX-62mRNA表达均增加(P<0.01)。结论COPD模型组大鼠第28天病理表现符合人类COPD的特征性病理改变，提示COPD大鼠模型建立成功。COPD模型组大鼠肺组织中CD86mRNA及OX-62mRNA的表达较正常对照组明显升高，提示树突状细胞(DCs)在COPD大鼠肺部表达增加，这可能是COPD发生发展的重要因素。

慢性阻塞性肺疾病；树突状细胞；荧光定量PCR

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一种常见的慢性呼吸系统疾病，其病死率及死亡率高，且发病机制仍有较多因素不清。目前免疫反应被认为是COPD发生发展的一个重要机制。DCs是体内功能最强的抗原递呈细胞,其最大特点是能够刺激初始T细胞增殖,诱导特异性免疫反应,是机体免疫应答的始动者[1]。本研究通过烟熏加脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)气道内注入建立大鼠COPD模型,从基因水平测定大鼠肺组织中DCsmRNA的表达变化，并探讨DCs与COPD发生发展的相关性如何，为其药物治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物与标本采集 清洁级雄性Wistar大鼠24只，由重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，[合格证号为：SCXK(渝)2007-0005]。通过烟熏+脂多糖方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型[2]。4周后取肺组织放入加有1 mLTrizol的EP管中，并立即放入-80 ℃冰箱保存，以备RNA提取。

1.2 主要实验试剂及仪器 脂多糖 (E.coli 055：B5)：美国Sigma公司产品，荧光定量RT-PCR试剂盒：大连TaKaRa公司，荧光定量RT-PCR引物(CD86、CD83、OX-62、β-actin) ：大连TaKaRa公司，逆转录试剂盒：大连TaKaRa公司，ICycler iQ荧光定量PCR仪 ：美国BIO-RAD公司。

1.3 荧光定量RT-PCR

1.3.1 cDNA的获取 采用Trizol一步法进行总RNA的提取，并用RT-PCR试剂盒转录成cDNA。调整各样品总RNA浓度，使反转录体系中总RNA量一致，均为2.0 μg，确保定量精确性。建立10.0 μL反转录体系：5×PrimeScriptTMBuffer(for Real Time) 2 μL;PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL;Oligo dT Primer(50 μm)*1 μL;Random 6mers(100 μm)*1 0.5 μL；Total RNA 3.5l；Rnase Free dH2O 3μL。逆转录反应条件：37 ℃ 15min，85 ℃ 5 s。所得产物储存于-80 ℃备用。建立15 μL荧光定量 PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM 7.5 μL;PCR Forward Primer(10 μm) 0.25 μL;PCR Reverse Primer(10 μm) 0.25 μL;cDNA模板3 μL ;dH2O 4 μL。荧光定量PCR反应条件：预变性 95 ℃ 3 min,变性 95 ℃ 10 s,退火延伸 61.1 ℃ 30 s,融解 55 ℃ 10 s,共40个循环。

1.3.2 PCR引物的设计和合成 大鼠CD86及OX-62引物及内参照β-actin引物由TaKaRa公司设计和合成，其序列如下(见表1)。

表1 PCR相关引物序列

名称 引物序列PCR产物(bp)CD86上游5'-GATTGCAGGTCCCAGTTCACTTC-3'下游5'-CCACTGTCCTGCTTGGACTCAC-3'135OX-62上游5'-TGGCATTCAGTGGTCTGTGCTA-3'下游5'-CACCAAGGATCGGCAGTTCA-3'121β-actin上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'150

2 结果

荧光定量PCR检测结果显示，与正常对照组相比，COPD模型组CD86 mRNA及OX-62 mRNA表达均增加(P<0.01，见表2、图1)。

组别CD86OX-62NS组0.82±0.591.00±0.32COPD组10.09±5.15*14.4±0.80*

注：*与对照组相比P<0.01。

注：CD86。 图1 RT-PCR扩增结果图

3 讨论

COPD是由多种复合因素构成的一种疾病，其中卷烟烟雾等慢性刺激作用于肺部，是导致COPD发病的首要危险因素。此外，一些环境暴露或职业粉尘暴露也是COPD致病的重要因素，这些环境或职业有机粉尘的活性成分主要是内毒素，它的主要成分是脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)。有文献报道，长期暴露于含有LPS的粉尘中可以导致患者出现类似于COPD的临床表现，本课题组前期已通过烟熏+脂多糖方法成功建立了COPD大鼠模型[2]。

目前国内外关于DCs与COPD的研究结果并不一致。Rogers等研究发现吸烟COPD患者上皮组织和上皮下组织中DCs数目比已戒烟COPD患者均明显减少[3]。刘俊达等研究COPD患者外周血DCs的表达，发现COPD急性加重期和稳定期DCs的数量均小于正常人[4]。但有的研究结论与其并不一致[5-6]。我们前期的研究采用FCM检测COPD患者、吸烟无COPD者及正常无吸烟者诱导痰中CD40和CD86的含量，发现COPD患者诱导痰中CD40和CD86的含量明显高于吸烟无COPD组及正常无吸烟组，进一步证实了DCs参与了COPD的发病过程[7]。本研究采用RT-PCR技术从基因水平来检测COPD模型大鼠肺脏中DCs的mRNA的表达变化。通过本实验得出结论：COPD模型组大鼠肺组织中CD86 mRNA及OX-62 mRNA的表达较正常对照组明显升高(P<0.01)，提示树突状细胞在大鼠肺组织中的表达增加，这可能是COPD发生发展的重要因素。

[1] Maria-Luisa del Rio,Jose-Ignacio,Elisabeth Kremmer,et al.CD103-and CD103+Bronchial Lymph Node Dendritic Cells Are Specialized in Presenting and Cross- Presenting Inocuous Antigen to CD4+ and CD8+ T Cells[J].J Immunol，2007, 178(9):6861-6866.

[2] 顾延会,欧阳瑶.烟熏联合脂多糖制备大鼠慢性阻塞性肺疾病动物模型[J].重庆医学,2012,41(13):1295-1296.

[3] Rogers A V,Edelroth,K Hattotuwa,et al.Bronchial mucosal dendritic cells in smokers and ex-smokers with COPD:an electron microscopic study[J]. Thorax, 2008,63:108-104.

[4] 刘骏达,郑小河,李雪影,等.慢性阻塞性肺病患者外周血树突状细胞的检测及其临床意义[J].海南医学,2005,16(3):8-9.

[5] 马朝辉,张晶,陈若华,等.慢性阻塞性肺病模型大鼠肺组织树突状细胞的数量变化及药物干预效果[J].第二军医大学学报,2009,30(6):706-709.

[6] 张宁,宋卫东.慢性阻塞性肺气肿的大鼠树突状细胞定量分析[J].中华全科医学,2010, 7(8):809-810.

[7] 欧阳瑶,符丹丹,薛令合.CD40和CD86在慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中的变化及意义[J].贵州医药,2011,35(6):487-490.

ExpressionofdendriticcellsmRNAinchronicobstructivepulmonarydiseaserats

Raoximin,Ouyangyao，Guyanhui

(Department of Respiratory Medicine,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo study the expression of Dendritic Cells (DCs) mRNA in the lung tissue of rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).MethodsCOPD was induced by established cigarette smoke inhalation and intratracheal LPS solution application. The pathomorphological changes in the lung were observed by hematoxylin-eosin staining (HE).The expressions of CD86 mRNA and OX-62 mRNA in lung tissue were observed by RT-PCR.ResultsThe changes of pathology of the COPD model group at 28-day mimicked the pathology of COPD patients. The expression of CD86 mRNA and OX-62 mRNA in the lung tissue were significantly increased in COPD model group, compared with normal control group (P<0.01).ConclusionThe COPD rat model was established successfully by this combined methods. The expressions of DCs mRNA were increased in the lungs of rats with COPD. COPD is associated with creased numbers of DCs.

Chronic Obstructive Pulmonary Disease; dendritic cells; Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

贵州省科技厅社发公关项目(NO：黔合科SY制[2009]3053)。

欧阳瑶，女，教授，硕士生导师，研究方向：COPD的发病机制，E-mail:ouyangyao116@sohu.com。

R563.3

A

1000-2715(2013)05-0410-03

[收稿2013-07-22;修回2013-09-18]

(编辑：谭秀荣)