口服戊酸雌二醇对自然更年期大鼠超敏C反应蛋白的影响

杨树琳 阮祥燕 蒋 辉 王 迎

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京100026;2.首都医科大学实验动物部，北京100069)

△作者现单位，首都医科大学附属北京朝阳医院京西院区妇产科

流行病学认为激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)不应用于已经罹患动脉粥样硬化的女性［1］，但是否可应用于动脉粥样硬化的一级预防结果存在争议［1－2］。血管慢性炎性反应过程被认为是动脉粥样硬化的中心环节［3］。C反应蛋白(C－reactive protein，CRP)、白介素 6(interleukin－6，IL－6)目前被公认为慢性低度炎性反应的标志物［4－6］，即使调整生活方式和代谢危险因素仍可作为炎性反应标志物。多项研究［7］显示CRP是2型糖尿病、动脉粥样硬化与心血管事件的预测因素。戊酸雌二醇是临床上常用的天然口服雌激素，本研究采用雌性自然更年期Sprague－Dawley(SD)大鼠建立自然绝经模型，探讨戊酸雌二醇灌胃给药对自然更年期大鼠血清超敏C反应蛋白(high sensitivity C－reactive protein，hs－CRP)与IL－6水平的影响，为绝经期妇女激素补充提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物

15月龄健康无特殊病原体(specific－pathogen free，SPF)级雌性SD大鼠70只，体质量330～520 g，由北京维通利华实验动物中心提供〔实验动物许可证号:SCXK(京)2006－0009〕。SD大鼠饲养于首都医科大学屏障环境动物室，室温22℃ ～26℃，湿度为40% ～60%，昼夜明暗交替时间比为12 h∶12 h，自由饮水和采食，房间定时通风消毒。所有实验均经首都医科大学伦理委员会批准。

1.2 主要实验仪器与试剂

全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)，电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特公司)，大鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒ESBL4287(美国EVER 公司)，大鼠卵泡刺激素(follicle－stimulating hormone，FSH)ELISA试剂盒 RE056(美国 Biosource公司)，大鼠超敏C反应蛋白(hs－CRP)ELISA试剂盒ESBL4484(美国 EVER公司)，大鼠白介素6(IL－6)ELISA试剂盒R6000B(美国RD公司)。

1.3 药物及用量

戊酸雌二醇(广州先灵药业有限公司生产，批号:国药准字J20080036)。大鼠灌胃计算公式参照文献［8］:戊酸雌二醇剂量(mg·kg－1)=6.25 ×2/60(mg·kg－1)≈0.21 mg·kg－1。戊酸雌二醇用无菌 0.9% 氯化钠注射液配制成戊酸雌二醇混悬液。动物每周定时测体质量，根据体质量计算每只大鼠每次需要灌胃量。

1.4 方法

1.4.1 样本量计算

1.4.2 动物模型的制备及分组

1)动物模型的制备:9月龄大鼠100只，每天定时取大鼠阴道脱落细胞于光学显微镜下观察。正常育龄期大鼠有规律动情周期:包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期［9］。根据阴道细胞形态判断大鼠动情周期存在状态［10］。动情前期:以底层细胞即圆核上皮细胞为主，少量的角化细胞和粒细胞;动情期:角化上皮细胞为主;动情后期:主要为粒细胞和角化细胞;动情间期:粒细胞为主，少量有核上皮细胞和黏液。连续观察36个动情周期(6个月，从9月龄至15月龄)后，筛选出阴道脱落细胞检查呈持续无角化状态，动情周期消失(预示即将或已经进入更年期)的70只大鼠，以自然老化法建立自然更年期模型大鼠建立。

2)分组:为排除实验时体质量干扰，对实验大鼠按体质量排序，采用数字表法随机分组［11］，将大鼠分为实验组和对照组，每组35只。分组后，以独立样本t检验对2组大鼠平均体质量进行两两比较，实验开始前实验组大鼠体质量为(420.16±24.76)g，对照组为(419.96±23.84)g，两组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

大鼠喂养1周适应后，实验组大鼠开始用戊酸雌二醇0.9%氯化钠注射液混悬液(1 mg戊酸雌二醇溶于10 mL 0.9%氯化钠注射液中制成混悬液)按照2.1 mL·kg－1灌胃，对照组给予等量0.9%氯化钠注射液。实验组灌胃期间意外死亡1只，对照组在此期间也意外死亡1只。2组大鼠每天灌胃1次，灌胃14周后腹主动脉取血后处死，血液标本经3 500 r·min－1离心10 min，取血清于1.5 mL EP管中，－80℃冰箱保存待测。

1.4.3 性激素、hs－CRP 及 IL－6 检测

竞争酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清雌二醇(estradiol，E2)和卵泡刺激素(follicle－stimulating hormone，FSH)浓度以及hs－CRP及IL－6水平。终止反应后30 min内，检测450 nm吸光度。所有检测均按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0进行数据处理。所有实验数据经 One－Sample Kolmogorov－Smirnov 检验其是否符合正态分布，正态分布数据以均数±标准差(ˉ±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组大鼠灌胃14周各检测指标正态性检验结果

灌胃14周时，实验组与对照组各检测指标均符合正态性分布(P＞0.05)，详见表1。

表1 实验组与对照组各检测指标正态性检验结果Tab.1 Normality distribution result of each index in the two groups

2.2 实验组与对照组大鼠E2和FSH水平比较

灌胃14周，实验组血清E2水平高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);实验组血清FSH水平低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表2。

表2 实验组与对照组大鼠灌胃14周血清E2、FSH水平比较Tab.2 The comparison of E2 and FSH levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表2 实验组与对照组大鼠灌胃14周血清E2、FSH水平比较Tab.2 The comparison of E2 and FSH levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

* P ＜0.05 vs control group;E2:estradiol;FSH:folliclestimulating hormone.

Group E2/(ng·L－1) FSH/(IU·L－1)Treatment 61.831±10.950* 3.887±2.070*Control 55.653±7.716 5.292±2.472

2.3 灌胃14周，实验组与对照组大鼠血清hs-CRP水平比较

灌胃14周，自然更年期大鼠实验组血清hs－CRP水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表3。

表3 实验组与对照组大鼠灌胃14周hs-CRP水平比较Tab.3 The comparison of hs-CRP levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表3 实验组与对照组大鼠灌胃14周hs-CRP水平比较Tab.3 The comparison of hs-CRP levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

* P ＜0.05 vs control group;hs-CRP;high sensitivity C－reactive protein.

Group hs－CRP/(pg·mL －1)Treatment 130.18±55.96*0.000 Control 190.82±80.73 P

2.4 灌胃14周，实验组与对照组大鼠IL-6水平比较

灌胃14周，自然更年期大鼠实验组血清IL－6较对照组有降低趋势(P＞0.05)，但两组之间差异无统计学意义，详见表4。

表4 灌胃14周两组大鼠血清IL-6水平的比较Tab.4 The comparison of IL-6 levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表4 灌胃14周两组大鼠血清IL-6水平的比较Tab.4 The comparison of IL-6 levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

IL-6:interleukin－6.

Group IL－6/(pg·mL －1)Treatment 44.65±40.28 Control 49.66±22.71 P 0.549

3 讨论

冠状动脉粥样硬化心脏病(以下简称冠心病)是绝经女性死亡的主要原因。近年来，研究者发现冠心病是慢性炎性反应性疾病［12］，研究［13］结果表明女性随着激素水平的下降，促炎性反应的水平会升高。本研究选择与心血管疾病风险密切相关的炎性反应因子 hs－CRP 和 IL－6，绝经妇女 hs－CRP 水平的研究一直是研究的热点，但结论尚有争议［14］，考虑 hs－CRP是一种非特异性的炎性反应因子，受机体多方面影响。本研究结果显示自然更年期大鼠体内hs－CRP水平升高，雌激素补充可以降低自然更年期大鼠血清hs－CRP的水平，不影响自然更年期大鼠血清IL－6的水平。

hs－CRP是在感染和组织损伤时血浆中快速升高的主要急性期蛋白之一，它由肝脏细胞合成并可在其他局部组织及部位(如动脉粥样硬化斑块中)的部分细胞内合成。hs－CRP的检测具有敏感、准确和可重复性的特点，在冠心病、脑卒中、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用［15－16］。近年流行病学研究［17］结果证实，hs－CRP与左室肥厚、急性冠状动脉综合征、胰岛素抵抗密切相关，并可预测冠心病、脑卒中的风险及预后［18］。绝经女性体内雌激素的降低同时伴随体内hs－CRP的升高会使绝经女性相对更加脆弱［19］。2004年，美国疾病控制和预防中心(CDC)与美国心脏病协会(AHA)联合发表炎性反应标志物与心血管疾病指南［20］，认为 hs－CRP在缺血性心脏病中是一种可靠和重要的标志物，美国心脏病学会推荐hs－CRP水平为评价冠心病人群危险度分层的依据之一，其中hs－CRP≥3 mg/L为高危人群的标准，hs－CRP超过20 mg/L需要考虑有无感染等其他非冠心病因素存在。

白细胞介素－6(IL－6)是相对分子质量为26 000的糖蛋白，主要由单核、巨噬细胞分泌，是肝脏急性时相反应的有力诱导剂，是肝脏C反应蛋白的主要刺激因子，作为重要的促炎性反应细胞因子，其在心血管等相关慢性病中的作用受到越来越多的关注。实验研究［21］表明IL－6可通过诱导内皮细胞的趋化因子和黏附分子的表达、释放，促进白细胞浸润，削弱内皮细胞产生内源性一氧化氮的能力，介导巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞，上调编码卵磷脂胆固醇酰基转移酶及载脂蛋白A－I的基因表达，致动脉粥样硬化损害的发展，对远期心血管事件具有预测价值［22］。临床及动物实验［23］也均已证实，急性心肌梗死后IL－6血清浓度增高。雌激素对IL－6的影响结果存在争议，有横断面研究［24］阐明绝经妇女较绝经前妇女IL－6水平无明显差异。Wakatsuki等［25］针对结合雌激素的研究发现血清炎性反应因子包括IL－6与雌激素剂量相关，大剂量可升高炎性反应因子水平，而低剂量则不会对血清炎性反应因子有影响。本研究发现自然更年期大鼠实验组血清IL－6较对照组有降低趋势，差异无统计学意义。推测本实验所用临床常用雌二醇换算剂量给予大鼠灌胃给药并没有升高自然更年期大鼠血清IL－6的水平。激素补充治疗对绝经妇女hs－CRP及IL－6水平的影响与激素种类、剂量及给药途径有关，口服戊酸雌二醇后可降低自然更年期大鼠血清hs－CRP水平，不升高IL－6水平，从而有利于降低心血管疾病的风险，为临床激素补充治疗提供一些理论参考。

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