没食子酸酯对神经细胞的抗氧化保护作用研究

田 伟，毕玉婷，周启龙，薛艳红，仇 敏，但飞君，刘士平

三峡大学化学与生命科学学院，宜昌 443002

神经细胞的氧化损伤会造成多种退行性疾病，如帕金森症(PD)、阿尔茨海默病(AD)和亨廷顿氏病(HD)等［1］。保护神经元免受氧化胁迫，在氧化应激的代谢途径中寻找合适的抗氧化剂，是防治这类疾病的有效手段之一［2，3］。没食子酸(gallic acid，GA，3，4，5-三羟基苯甲酸)，是一种抗氧化活性较高的天然产物，可清除机体内的氧自由基，但由于其有强刺激性和细胞毒性，油溶性差，所以在临床上常用其酯类作为抗氧化剂［4］。如没食子酸丙酯(Propyl gallate，PG)能有效防护脂氧化作用对细胞的损伤，对细胞的毒副作用很小，是美国、欧盟和世界卫生组织批准使用的抗氧化剂［4］。本文从三峡流域特有濒危植物疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)［5］中分离到一种3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯(没食子酸甲酯的衍生物，以下简称二甲氧酯)，建立了过氧化氢对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的氧化损伤模型，比较了它与没食子酸乙酯、没食子酸正丙酯、没食子酸异戊酯，没食子酸正辛酯对神经细胞氧化损伤的保护作用，探讨了其细胞毒性的差异，以期为新型神经退行性疾病药物的开发和设计提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验中使用的试剂有:D-MEM/F-12完全培养基(内含2.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL青霉素，100 μg/mL 链霉素，10% 新生小牛血清)，D-MEM/F-12基础培养基(内含3%新生小牛血清)，胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，四氮唑蓝(MTT，美国AMRESCO公司)，过氧化氢(H2O2，国药集团西安公司)。试剂均为分析纯。

人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y由华中科技大学同济医学院实验动物中心惠赠。没食子酸酯系列化合物(没食子酸乙酯、没食子酸正丙酯、没食子酸异戊酯、没食子酸正辛酯)均通过有机合成方法获得(样品纯度均达到99%以上)，来自于三峡大学化学与生命科学学院但飞君教授实验室。

实验所需仪器主要有酶联免疫检测仪(Genios Tecan)，核磁共振仪(UltrashiedTM，Bruker)，CO2培养箱(日本三洋公司)，LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)，XDS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)，96孔板(美国Corning公司)。

1.2 3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯的分离与鉴定

取干燥的疏花水柏枝研磨成粉末，用95%乙醇回流提取，提取液减压浓缩得总浸膏。总浸膏用适量4%HCl冷浸，酸水液用饱和Na2CO3依次调pH至7、10、12，分别用氯仿萃取，浓缩得不同pH条件下的提取物和沉淀。其中pH7条件下的提取物，经氯仿、甲醇梯度洗脱硅胶柱层析及Sephadex LH-20、制备薄层法(PTLC)、重结晶等技术手段分离1个单体化合物，经1H NMR、13C NMR鉴定为3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯，分子式为C10H12O。

1.3 没食子酸酯系列药物溶液的制备

分别取3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸正丙酯、没食子酸异戊酯、没食子酸正辛酯5 mg，置于EP管中，各加入50 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再加入450 μL无水乙醇，配成终浓度为10 mg/mL的药物溶液备用。

1.4 细胞培养

SH-SY5Y细胞用D-MEM/F-12完全培养基于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。细胞每2 d换一次培养基，待细胞80% ～90%铺满瓶底时进行传代、转板。在传代时，倒掉旧培养基后，先用PBS缓冲液将细胞清洗，再用0.25%的胰蛋白酶置于CO2培养箱中进行干消化约40 s，离心后按1∶3比例进行传代［7］。

1.5 细胞毒性试验

为评价药物对细胞的毒害作用并确定最适给药浓度，我们用MTT法评价了不同药物的细胞毒性。将对数生长期的SH-SY5Y细胞稀释后，接种于96孔板中，待神经细胞生长至80%汇合时，加入浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 的各种药物，加药量为100 μL/孔。培养24 h后弃去培养液，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的培养基继续培养4h，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，轻轻振摇96孔板使甲瓒颗粒充分溶解，用全自动酶联免疫检测仪于492 nm波长处测定吸光度(OD)值，计算细胞存活率(存活率=处理组OD值/空白组OD值×100% ，下同)［8］。

1.6 H2O2氧化损伤模型的建立

神经细胞生长至80%汇合时，弃去旧培养液，加入不同浓度(400、600、800、1000 μmol/L)的 H2O2溶液(基础培养基稀释而成)，空白对照组只加入基础培养基，继续培养8 h后用MTT法测吸光值，计算细胞存活率。选取50%～60%细胞死亡的H2O2浓度进行后续实验［9］。

1.7 没食子酸酯系列药物的筛选及量效关系分析

SH-SY5Y细胞生长至80%汇合时进行预给药，分别加入浓度梯度为 25、12.5、6.25、3.125、1.0625 μg/mL的没食子酸酯类化合物(基础培养基配制而成)，每个浓度5个复孔。培养24 h后弃去培养液，模型组加入浓度为800 μmol/L的H2O2溶液，给药组加入相应浓度的药物及浓度为800 μmol/L的H2O2溶液，继续培养8 h后用MTT法测吸光值，计算细胞存活率［10］。

1.8 统计学处理

2 结果与分析

2.1 3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯的分离与鉴定

疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)是一种分布在三峡河岸带地区的珍稀民间药材，当地人常用来治疗风湿、烫伤等疾病。本实验用干燥的疏花水柏枝粉末，经回流提取、减压浓缩后，在pH7条件下经柱层析、重结晶分离到1个单体化合物。该物质为淡黄色粉末，1H NMR(CD3OD-d4，400 MHz)δ:7.16(d，J=1.6 Hz，1H ，H-2)，，7.15(d，J=1.6 Hz，1H，H-6)，3.87(s，3H，3-OCH3)，3.86(s，3H，4-OCH3)，3.84(s，3H，8-OCH3);13C NMR(CD3OD-d4，100 MHz)δ:126.5(C-1)，111.9(C-2)，151.6(C-3)，142.0(C-4)，154.4(C-5)，105.9(C-6)，168.3(C-7)，51.9(C-8)，55.8(C-9)，59.9(C-10)。其波谱数据与文献中数据对照一致［6］，故鉴定为3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯，分子式为C10H12O5。

图1 3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯的化学结构Fig.1 Chemical structure of 3，4-dimethoxy-5-hydroxy benzoic acid methyl ester

2.2 H2O2氧化损伤模型的建立

为明确没食子酸酯类物质对神经细胞的抗氧化保护作用，我们先构建了H2O2对SH-SY5Y细胞的氧化损伤模型。结果显示随着H2O2浓度的增加，SH-SY5Y细胞的损伤作用越明显，细胞存活率逐渐降低。800 μmol/L H2O2能导致约60%的SH-SY5Y细胞死亡(存活率41.6%)，因此选用此浓度的H2O2建立了稳定的氧化损伤模型(图2、图4)。

图2 H2O2对SH-SY5Y细胞存活率的影响，＊＊ P＜0.01，n=5。Fig.2 Influence of H2O2concentrations on viability rate of SH-SY5Y cells，＊＊ P ＜0.01，n=5.

2.3 没食子酸酯系列化合物对SH-SY5Y细胞的毒性评价

由于没食子酸酯系列化合物对神经细胞具有潜在的毒性，试验中我们考察了这些不同浓度的单体对SH-SY5Y细胞存活率的影响。结果显示(表1)二甲氧酯、没食子酸正丙酯和没食子酸异戊酯在较低浓度(6.25 μg/mL)时可促进SH-SY5Y细胞的生长，其它没食子酸酯化合物随着浓度的增加，对SHSY5Y细胞的毒害作用加强。在0～25 μg/mL浓度范围内，没食子酸酯系列化合物对SH-SY5Y细胞的毒害作用较小，选用此浓度范围进行没食子酸酯系列化合物抗氧化保护作用分析。

表1 没食子酸酯对SH-SY5Y细胞的生长抑制作用Table 1 Influence of gallate esters on growth of SH-SY5Y cells

2.4 没食子酸酯抗氧化保护作用分析

为了探究没食子酸酯系列化合物对双氧水所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，本文特采用空白组，模型组，给药组三种处理方式，给药组加入不同浓度梯度(1.063、3.125、6.25、12.5 和 25 μg/mL)的没食子酸酯类。将三种处理方式的OD492进行比较，分析没食子酸酯系列化合物对神经细胞氧化损伤的保护作用(图3和4)。

实验结果表明，二甲氧酯、没食子酸乙酯、正丙酯、异戊酯加药后，细胞存活率有明显提升，说明对神经细胞都有显著的抗氧化保护作用，可以将皱缩的细胞恢复成近伸展的状态，而没食子酸正辛酯对双氧水所致SH-SY5Y细胞损害的保护作用并不明显(图3、图4)。另外，不是所有的抗氧化保护作用都有浓度依赖性，其中二甲氧酯和没食子酸乙酯的最适浓度为为6.25 μg/mL，但是神经细胞却对没食子酸丙酯和异戊酯的浓度显得并不敏感。尤其需要指出的是，与广泛使用的抗氧化剂没食子酸正丙酯相比较，二甲氧酯和没食子酸乙酯的保护作用也相当突出，表明其可作为潜在的抗氧化剂而广泛使用。

图3 没食子酸酯类化合物对SH-SY5Y细胞的氧化损伤保护作用Fig.3 Oxidative damage protection of gallate esters to SH-SY5Y cells

图4 过氧化氢致SH-SY5Y细胞氧化损伤及没食子酸酯类化合物的保护作用(×200)Fig.4 Oxidation injury induced by H2O2and theprotection effects of gallate esters to nerve cells(×200)

3 讨论

在许多退化性神经系统疾病中，都涉及到活性氧能诱导的细胞凋亡，因此保护神经元免受氧化应激损伤，是防治该类疾病的有效手段之一。目前，治疗神经退行性疾病的主要临床药物大多为生物碱类结构，本文在构建了过氧化氢对神经细胞的氧化应激模型后，探讨了不同没食子酸酯类的抗氧化保护作用，实验结果表明大多没食子酸酯类都对神经细胞有一定的抗氧化保护作用，为神经退行性疾病的药物设计提供了一定的参考价值。

由于没食子酸正丙酯是一种广泛使用的抗氧化剂，此外它还有有抗血小板聚集、抗炎、逆转恢复受损神经细胞等作用，在医药和食品工业中得到极大的关注。然而本文从三峡流域特有濒危植物疏花水柏枝中分离到的一种天然产物，即3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯，为没食子酸甲酯的衍生物，却对神经细胞显示出比没食子酸正丙酯更好的抗氧化保护作用，表明其有潜在的药用价值。

但是没食子酸正辛酯有点例外，与实验中所用的其他没食子酸酯类相比，其抗氧化保护作用很小，可能与其本生的毒性作用较大有关，因此是否由于其参与成酯的烃基较大，影响了细胞的正常生长，从而降低了它的抗氧化作用，这有待于进一步研究。

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