银杏叶提取物的Py-GC-MS分析及其在卷烟中的应用

蒋国斌，徐 莉，李国政，雷 萌，王燕芹，陈 泳，唐 颖

1南京林业大学理学院;2南京林业大学森林资源与环境学院;3南京林业大学现代分析测试中心，南京 210037;4河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州 450016

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶，具有较高的生物活性和药用价值。银杏叶提取物(Ginkgo biloba leaves extract，EGB)成分复杂，主要含黄酮类、内酯类、原花青素类等，具有广泛的药理作用，临床用于预防和治疗心脑血管疾病。德国施瓦伯(Schwabe)公司生产的银杏叶标准提取物EGB761享誉世界，其丙酮-水专利工艺提取的EGB761主要组分见表1［1，2］。银杏叶黄酮和内酯是重要的生理活性物质，黄酮能够扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，增强毛细血管抵抗力，降血压，降血脂，萜内酯是高选择性的血小板活化因子拮抗剂;银杏叶黄酮、原花青素还是有效的天然自由基清除剂，以优越的抗氧化性和较小的副作用应用于功能食品、保健品和化妆品中［3-5］。近几十年围绕着治疗心脑血管疾病，国内外学者对EGB进行了广泛深入的研究，但在其它领域的应用如在卷烟中的应用研究较少。

卷烟烟气中含有多种有害物质，如烟碱、CO、焦油、醛等，同时含有大量对人体有害的自由基。在燃吸过程中，烟丝和烟用添加剂中的化学成分经历蒸馏、裂解、聚合、燃烧、冷凝等一系列反应，其中裂解是卷烟燃烧过程的重要环节。研究卷烟添加剂在烟气中的裂解行为及裂解产物，有助于了解卷烟添加剂和烟丝化学成分在卷烟燃烧过程中迁移转化机理［6］。热裂解-气相色谱-质谱(Py-GC-MS)方法是模拟卷烟燃烧过程的有效手段，广泛用于植物提取物及单体物质的燃烧裂解产物研究。黄酮类化合物在银杏叶提取物中含量较高，也是烟草中主要的多酚类物质［7］，是烟草中重要的前体物质［8］和潜香类物质［9］，燃烧能产生多种香味物质。鹿洪亮［10］提取银杏叶中的挥发油后进行了热裂解产物研究并将其应用于卷烟中，发现能与烟香协调，提高香气质，增大香气量，余味有所改善。目前，大部分热裂解研究是在无氧氛围中进行，近年来研究人员开始尝试在有氧氛围中进行裂解。

表1 银杏叶标准提取物EGB761中不同类别组分Table 1 Different classes of compounds presented in the standardised Ginkgo extract EGB761

本试验运用Py-GC-MS法分析EGB的有氧热裂解产物，通过加香试验对EGB卷烟进行感官质量评价，为黄酮类物质及植物提取物在卷烟燃烧过程中的转化行为提供参考，为银杏叶提取物在卷烟中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与样品

CDS5200热裂解仪(美国CDS公司);Agilent 7890A/5975C GC/MS联用仪(美国Agilent公司);Waters E2695 HPLC色谱仪(美国 Waters公司);Precisa XS-225A-SCS电子天平(感量:0.001g，瑞士Precisa公司)。

EGB粉末，批号TYG120413，西安天一生物技术有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 热裂解试验

称取0.001(±0.0002)g干燥EGB样品，置于裂解仪专用石英管中，两端用石英棉堵塞，然后装入热裂解仪铂金探头中进行热裂解，裂解完毕后铂金探头用高温(1200℃)累计清洗2 min。所有裂解试验平行两次。

1.2.1.1 热裂解条件

裂解氛围为空气;初始温度为50℃，保持1 s，以10℃/ms的速率分别升至300、600、800、900℃，保持20 s;热裂解产物直接导入GC/MS中进行分析。

1.2.1.2 吸附阱条件

吸附温度为60℃，解吸附温度为250℃，解吸附2 min。

1.2.1.3 GC条件

色谱柱:HP-Innowax毛细管柱(30 m×0.250 mm i.d.，0.25 μm d.f.);进样口温度为 250 ℃;分流比为10∶1;载气为He;流速为1 mL/min;升温程序为:初始温度为50℃，保持4 min，以5℃/min的速率升至220℃，保持2 min。

1.2.1.4 MS条件

EI离子源温度:230℃;四极杆温度:150℃;电离能:70 eV;扫描模式:全扫描;扫描质量范围:35～450 amu;溶剂延迟:2 min。采用NIST05a标准质谱数据库检索定性，总离子流图峰面积归一化法半定量。

1.2.2 加香试验

称取EGB粉末1 g，完全溶于100 mL无水乙醇，形成10 mg/mL的EGB溶液。分别量取0、2.5、5、10 mL溶液，无水乙醇定容至50 mL，用喷雾器分别喷洒在100 g黄金叶烟丝上。喷洒完毕后存放过夜使烟丝充分吸收溶液，低温干燥后制成卷烟，恒温(22±1℃)恒湿(相对湿度60% ±2%)环境下平衡48 h，以未加EGB的卷烟为对照，由郑州中烟工业公司技术中心评吸小组评价比较。

2 结果与讨论

2.1 EGB质量控制

将EGB样品溶于90%乙醇溶液中，用HPLC按照指定方法［11］检测黄酮醇苷、萜内酯、酚酸含量，结果黄酮醇苷含量29.87%(≥24%)，萜内酯含量6.14%(≥6%)，酚酸含量0.4 ppm(≤1 ppm)，符合国家药典标准。

2.2 GC升温程序优化

本试验对GC升温程序进行了优化。选定色谱柱后，将升温速率设为5℃/min，终温250℃，发现谱图后期基线漂移，将升温速率调整为4℃/min后基线较平稳，但运行时间较长，且45 min后无出峰，故将终温调整为220℃，保持2 min。观察总离子流图发现保留时间在3～6 min之间的几个峰分离不好，将初始温度保持时间由2 min延长至4 min后解决了这一问题。

2.3 热裂解氛围的选择

一般认为典型的卷烟燃烧过程中，分成3个主要反应区:靠近抽吸端的低温冷凝区温度低于100℃，中温裂解蒸馏区温度在400～600℃，高温燃烧区温度通常600～900℃［12］，平均燃烧温度约为800℃。卷烟的燃烧主要是在有氧的环境下进行，无氧氛围下进行的热裂解试验与卷烟有氧燃烧的大气环境有较大差异。600～900℃的燃烧区，处于富氧状态，主要发生的是氧化反应，用Py-GC/MS联用技术模拟卷烟燃烧，空气氛围下得到的裂解产物类型更接近燃烧区［13］。近年来热裂解主要停留在无氧氛围，有氧氛围中进行裂解的报道较少，本试验选用空气为裂解氛围。

2.4 热裂解条件的优化

本试验研究了裂解最终温度持续时间对裂解产物的影响，选用800℃为最终温度，裂解速率10℃/ms，将终温持续时间分别设为 5、10、15、20、30 s，其它条件一致，结果不同终温持续时间下得到样品的总离子流图(TIC)能较好地吻合，随着终温持续时间增长，谱图丰度值不断增大，到20 s时基本不再增加，说明EGB 20 s已能裂解完全，因此选定20 s为裂解持续时间。

2.5 热裂解产物的总离子流图

在烟用添加剂的热裂解研究中，一般选取卷烟具有代表性的3个温度300、600、900℃作为裂解温度，分别代表挥发性物质开始进入烟气、烟草开始燃烧和抽吸时最高温度［14］。800℃是卷烟正常抽吸时的平均燃烧温度，因此本试验选择300、600、800、900℃作为热裂解温度对EGB裂解产物进行考察，产物的总离子流图见图2。

图2 不同温度下EGB热裂解产物的TIC图(丰度值/保留时间)Fig.2 TICs of EGB pyrolysis products at different temperature(Abundance value/Retention time)

可以看出，不同温度下EGB的裂解产物成分和含量变化较大，随着温度的不断升高，裂解产物数量明显增多，成分变得复杂，含量差异较大。

2.6 热裂解产物的种类和含量

利用NIST05a标准质谱数据库，对EGB在300、600、800、900℃下裂解产物进行定性分析，并用峰面积归一化法对各裂解产物的相对质量分数定量，为提高方法的可靠性，所有裂解试验平行两次取平均值，所有检测结果与平均值的相对标准偏差RSD值均小于6%［13］，匹配度85%以上的产物名称及质量分数见表2。

表2 不同温度下EGB的热裂解产物Table 2 EGB pyrolysis products at different temperature

22.10 萘Naphthalene C10H8 91 - - 0.64% 2.24%23.45 3-甲基-2-丁烯酸 2-Butenoic acid，3-methyl- C5H8O2 92 - 0.35% - -24.10 甲基环戊烯醇酮Methylcyclopentenolone C6H8O2 90 1.17% 0.89% 0.78% 0.38%24.79 愈创木酚Guaiacol C7H8O2 94 2.30% 1.52% 0.91% -25.84 β-苯乙醇 β-Phenylethyl alcohol C8H10O 89 - 0.64% 0.51% -26.44 2-苯氧基乙醇2-Phenoxyethanol C8H10O2 87 0.90% - - -26.74 2-甲氧基-5-甲基-苯酚 Phenol，2-methoxy-5-methyl- C8H10O2 94 8.18% 4.08% 4.32% 3.18%26.93 2-甲氧基-4-甲基-苯酚 Phenol，2-methoxy-4-methyl- C8H10O2 87 2.41% 1.82% 1.12% 1.31%27.352-甲基-2，3-二氢-1-茚酮 1H-Inden-1-one，2，3-dihydro-2-methyl-C10H10O 91 4.06% - - -27.72 α-二氢茚酮 α-Hydrindone C9H8O 90 8.85% - - -27.77 苯酚Phenol C6H6O 93 3.70% 8.93% 7.64% 5.41%27.99 氨基甲酸苯酯 Carbamic acid，phenyl ester C7H7NO2 87 - 0.54% 0.20% -28.19 4-乙基-2-甲氧基-苯酚 Phenol，4-ethyl-2-methoxy- C9H12O2 91 8.50% 3.17% 2.42% 2.62%29.24 对甲苯酚p-Cresol C7H8O 96 13.36% 8.42% 6.64% 5.39%29.38 3-甲基-苯酚 m-Cresol C7H8O 92 4.85% 2.60% 1.41% 1.13%30.79 异丁香酚Isoeugenol C10H12O2 96 2.63% 1.89% 0.78% -30.97 4-乙基-苯酚 Phenol，4-ethyl- C8H10O 91 6.54% 4.64% 1.96% 2.33%31.35 4-乙烯基愈创木酚4-vinylguaiacol C9H10O2 95 9.96% 7.30% 3.07% 4.96%32.61 2，6-二甲氧基-苯酚 Phenol，2，6-dimethoxy- C8H10O3 88 2.64% 1.70% 1.18% 1.07%32.99 5-羟基-麦芽酚5-Hydroxymaltol C6H6O4 86 2.20% - - -33.87 佳味酚Chavicol C9H10O 89 0.31% 0.20% 0.17% -34.01 丁香酚Eugenol C10H12O2 97 1.92% 1.31% 0.91% -35.64 吲哚Indole C8H7N 91 1.25% 0.22% - -37.57 香兰素Vanillin C8H8O393 1.49% - - -

由表2可知，EGB 在300、600、800、900 ℃下依次鉴定出22、42、47、39种裂解产物，共58种产物，不同温度下的产物成分和含量变化较大，低温300℃产生较多的致香物质，高温800～900℃则出现少量有害物质。EGB在不同温度下裂解主要生成烃类、酮类、醇类、醛类、酚类、呋喃类、酸类、芳香族化合物及其衍生物。不同温度下EGB发生不同程度的化学键断裂和反应，低温下只发生简单裂解生成多种苯环衍生物如苯乙烯、苯甲酸等，高温下进一步裂解破坏生成更复杂产物。

300℃时裂解产物数量较少，其中香味物质较多，为醛、酮、酚、醇、酯类物质，如 5-甲基-2-糠醛、甲基环戊烯醇酮、愈创木酚、2-苯氧基乙醇、对甲苯酚、异丁香酚、4-乙烯基愈创木酚、5-羟基-麦芽酚、丁香酚、香兰素等，单一成分含量最高的对甲苯酚为13.36%。

600℃时裂解产物数量急剧增多，上述香味物质基本存在，相对质量分数基本持平，其中5-甲基-2-糠醛、4-乙烯基愈创木酚等香味物质均有不同程度的减少;同时生成了多种烷烃类、醛类、酮类和呋喃类物质，其中也有α-松油烯、苧烯等香味物质。600℃单一成分最高的苯酚含量为8.93%。

800℃时裂解产物数量进一步增加，至900℃略有减少，其中香味物质大量减少，如异丁香酚、香兰素等基本消失，出现了一些苯系物、多环芳烃类有害物质，如苯、甲苯、二甲苯、萘、1，2，4-三甲基-苯等，这些物质均在著名的Hoffmann名单或加拿大卫生部卷烟烟气有害成分名单［8］之中。900℃单一成分最高的仍然是苯酚，含量升降至5.41%。

2.7 致香产物的分布规律

EGB所有58种裂解产物中有23种致香物质。这些物质有着各自独特的嗅觉特征，具有定香和助香作用，能够提高卷烟的香气，是食品、烟草等行业重要的香料和添加剂(见表3)。由图3、图4可以看出，300℃时EGB的裂解产物较少，但致香物质比例较高，占产物总数的54.5%，随着温度的升高，裂解产物种类不断增多，但致香物质所占的比例不断降低，900℃时降为最低的25.6%。经计算，如图4所示，裂解产物中香味物质占总产物质量百分比随着温度亦呈现下降趋势，300℃时最高为40.7%，600℃时为39.7%，800℃时降为25.6%，900℃时降至最低18.4%。

表3 EGB热裂解产物中的香味物质Table 3 Flavoring substances of EGB pyrolysis products

图3 不同温度下EGB裂解产物及致香产物数量分布Fig.3 Quantity of EGB pyrolysis products and flavoring substances at different temperatures

图4 不同温度下EGB致香产物数量及质量比例Fig.4 Quantity and mass fraction of EGB pyrolysis flavoring substances at different temperatures

EGB裂解23种致香产物中，所占质量比重较大的分别为对甲苯酚、4-乙烯基愈创木酚、α-松油烯、5-甲基-2-糠醛、愈创木酚、甲基环戊烯醇酮、苯乙烯。图5选取了这几种代表性致香物质，不难发现这些产物总体呈现随着裂解温度升高相对质量分数下降的趋势。其中5-甲基-2-糠醛、甲基环戊烯醇酮、对甲苯酚、4-乙烯基愈创木酚在各个裂解温度中均存在，但含量有差别，含量随着温度升高而降低。α-松油烯和苯乙烯在低温300℃时检测不到，α-松油烯在600℃释放量急剧增加;而愈创木酚、甲基环戊烯醇酮在高温900℃基本检测不到。

图5 EGB部分致香产物相对质量分数随温度变化Fig.5 Relative mass fraction of some EGB pyrolysis flavoring substances varied with the changing of temperature

2.8 裂解产物中的有害物质

EGB在裂解过程中，特别是在高温下会产生一些苯系物、多环芳烃类有害物质，如苯、甲苯、对二甲苯、萘、1，2，4-三甲基苯、苯并呋喃等，含量总和比重为7.63%，含量最高的为苯5.26%。图6选取了上述几种有害物质，可以看出这些物质在裂解产物中含量较低，很多仅在高温时产生，低温300℃都无释放。其中苯和甲苯含量较高，但仅在高温800～900℃才开始生成，对二甲苯、萘也在800℃开始生成，1，2，4-三甲基苯、苯并呋喃在600℃开始生成，含量低于1%。

图6 EGB裂解产物中几种有害物质相对质量分数随温度变化Fig.6 Relative mass fraction of some EGB pyrolysis harmful substances varied with the changing of temperature

2.9 EGB卷烟的感官质量评价

由于卷烟燃烧的复杂性，上述热裂解试验是对卷烟真实吸燃情况的模拟，将EGB溶液加入烟丝中制成卷烟进行感官评吸，将更有助于评价EGB裂解产物对卷烟抽吸品质的实际影响。

按1.2.2所述方法，分别加入质量浓度0.025%、0.05%、0.1%、0.5%EGB制成卷烟对其加香效果进行感官质量评价。结果表明(见表4):加样量为0.025～0.05%时，烟丝光泽油润，无异味，能不同程度地增加香气质和香气量、减少杂气和刺激性、提高舒适度，其中加入0.025%时效果较好。当加样量为0.5%时，对卷烟感官质量有一定的降低作用。

表4 EGB不同加样量的感官质量评价Table 4 Sensory quality evaluation of different adding amount of EGB sample

3 结论

EGB在不同温度下裂解产物共58种，主要为烃类、酮类、醇类、酸类、醛类、酚类、呋喃、芳香族化合物及其衍生物，300、600、800、900 ℃下依次鉴定出22、42、47、39种裂解产物，不同温度下的产物成分和含量变化较大。裂解产物中香味物质数量达23种，如5-甲基-2-糠醛、甲基环戊烯醇酮、愈创木酚、2-苯氧基乙醇、对甲苯酚、异丁香酚、4-乙烯基愈创木酚、5-羟基-麦芽酚、丁香酚、香兰素等，它们具有天然的芳香气味，具有定香和助香作用，能够提高卷烟的香气。这些香味物质在低温300～600℃时含量较高，随着温度升高而降低，至900℃时基本消失，产生少量苯系物、多环芳烃、呋喃类等有害物质。

EGB裂解产中香味物质种类及相对质量分数所占比例均随着温度升高不断降低，所占质量比重较大的分别为对甲苯酚、4-乙烯基愈创木酚、α-松油烯、5-甲基-2-糠醛、愈创木酚、甲基环戊烯醇酮、苯乙烯。EGB裂解产生的苯、甲苯、对二甲苯、萘、1，2，4-三甲基苯、苯并呋喃等有害物质相对质量分数很低，很多仅在高温时产生。

选用研究较少的有氧氛围进行热裂解。卷烟的燃烧主要是在有氧的环境下进行，空气氛围检测结果与卷烟实际燃烧的大气环境更接近更科学。通过运用模拟卷烟燃烧常用手段Py-GC-MS法进行EGB热裂解，为研究其它黄酮类物质、植物提取物在卷烟燃烧中转化行为提供参考，为银杏叶提取物在卷烟中的应用提供依据。将不同浓度的EGB加入烟丝中制成卷烟进行感官评吸，发现加样量为0.025%时，能增加香气质和香气量，减少杂气和刺激性，提高舒适度，效果较好。

1 Xie PS(谢培山).Quality evaluation of Ginkgo biloba leaves standardized extract EGB761 and its preparation.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，1999，24:3-5.

2 van Beek TA，Montoro P.Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves，extracts，and phytopharmaceuticals.J Chromatogr A，2009，1216:2002-2032.

3 Mou LL(牟玲丽)，Kou JP(寇俊萍)，Zhu DN(朱丹妮)，et al.Antioxidant activities of the chemical constituents isolated from the leaves of Ginkgo biloba．Chin J Nat Med(中国天然药物)，2008，6:26-29.

4 Liu XP，Luan JJ，Goldring CE.Comparison of the antioxidant activity amongst Gingko biloba extract and its main components.J Chin Med Mater，2009，32:736-740.

5 Shi B(石碧)，Du X(杜晓).The progress on research and utilization of plant proanthocyanidins.J Sichuan Univ，Eng Sci Edit(四川大学学报，工程科学版)，2006，38:16-24.

6 Senneca O，Ciaravolo S，Nunziata A.Composition of the gaseous products of pyrolysis of tobacco under inert and oxidative conditions.J Anal Appl Pyrolysis，2007，79:234-243.

7 Li ZM(李丛民).Plant polyphenols affect the quality of tobacco products.Toba Sci Tech(烟草科技)，2000，1:27-28.

8 Czegeny Z，Blazso M，Varhegyi G，et al.Formation of selected toxicants from tobacco under different pyrolysis conditions.J Anal Appl Pyrolysis，2009，85:47-53.

9 Moreno Alvarez，MJ，Guaran CY，Belen Camacho DR，et al.Effect of flavonoid extracts from grapefruit seeds and peel flour on soybean oil stability.Grasas Aceites，2007，58:351-358.

10 Lu HL(鹿洪亮).Analysis of pyrolysis constituents in essential oil of Ginkgo biloba leaves and its application in cigarettes.Chin Toba Sci(中国烟草科学)，2011，32:66-70.

11 Xie P，Chen S，Liang Y，et al.Chromatographic fingerprint analysis--a rational approach for quality assessment of traditional Chinese herbal medicine.J Chromatogr A，2006，1112:171-180.

12 Kong HH(孔浩辉)，Lu H(鲁虹)，Chen CL(陈翠玲).Pyrolysing study of tobaccos under inert and oxidative conditions.J Instru Anal(分析测试学报)，2010，29:612-616.

13 Lu H(鲁虹).Simulation the combustion process of cigarettes by pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry technology.Guangzhou:Sun Yat-sen University(中山大学)，MSc.2010.

14 Xu Y(许永)，Xiang NJ(向能军)，Gao Q(高茜).Analysis of pyrolysis products of Hangzhou white chrysanthemum extract by gas chromatography/mass spectrometry.Fin Chem(精细化工)，2008，25:766-770.