超声辅助双水相体系提取国槐叶黄酮

李彩霞，高海宁* ，张喜峰，张国强

1河西学院农业与生物技术学院;2甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖 734000

黄酮类化合物是植物重要的次级代谢产物，广泛存在于植物的各个器官，包括根、茎、叶、果实及花中。研究发现黄酮类化合物具有抗氧化、抗感染、抗肿瘤［1-3］、抗病毒［4］、保肝［1，2］等多种生理功能，因而黄酮被称为“第七类营养素。由于黄酮具有很好的医药保健等功能，因此近年来植物中黄酮的提取及活性已经成为人们研究的热点。

国槐(Sophora japonica L.)为豆科槐属的落叶乔木，别名槐树、中国槐、槐米树等。国槐国内种植范围广，资源丰富，是绿化树，行道树，蜜源树的优良品种之一，国槐叶每年秋季脱落后，全部被废弃或者置于路旁，利用率很低，造成资源的巨大浪费。近年来，国槐中生物活性物质的已引起了国内许多研究者的重视，龚盛昭等［3］从槐米中对芦丁和黄酮类物质进行了提取;丛艳波等［4］用微波辅助提取法对槐角总异黄酮工艺进行了研究，对国槐叶的研究多限于黄酮的提取及含量测定［5，6］，而未涉及到黄酮提取工艺的系统研究。

传统的提取方法如溶剂浸提法，不仅提取不完全，耗时，而且溶剂浪费严重。超声波提取法具有空化效应、粉碎作用，对植物细胞有破坏现象，能使所提取物质很好的溶于溶剂中，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点［7］。双水相萃取是一种温和的新型分离技术，因其成相时间短、活性成分保持好、过程容易放大、生物亲和性好等优点已经被广泛应用于重金属离子、食品化工、植物有效成分的分离［8］。基于此，本实验以国槐叶为材料，采用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取黄酮，通过单因素试验和BB设计及响应面分析对槐叶黄酮提取条件进行优化，其目的为槐叶活性成分的开发利用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

国槐叶，2011.10.7采自河西学院，洗净阴干，粉碎冷藏备用。

1.2 试剂

芦丁，美国Sigma公司;无水乙醇、硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

FZ102微型植物试样粉碎机(河北黄骅新兴电器厂);KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);S24分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);AP-9925无油真空泵(天津奥特塞恩斯仪器有限公司);AE200电子分析天平(Mettler Toledo公司)。

2 方法

2.1 乙醇-硫酸铵双水相体系制备

乙醇-硫酸铵双水相体系制备参阅文献［9］。在水溶性无水乙醇中加入硫酸铵，利用硫酸铵的盐析作用形成双水相体系，通过改变无水乙醇与蒸馏水的比例和硫酸铵的用量来控制双水相体系的形成。本文选取的双水相体系乙醇与水的初始体积之比为0.76，硫酸铵用量为0.23 g/mL，即30%(w/w)的乙醇和20%(w/w)硫酸铵组成双水相体系。

2.2 黄酮的提取及含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制

黄酮测定参阅文献［10］，芦丁标准溶液的配制，准确称取干燥至恒重芦丁标准品20 mg;加入10 mL70%的乙醇置于水浴锅中微热使之溶解，冷却，转移至100 mL容量瓶中定容。芦丁标准品的浓度为0.2 mg/mL，冷藏备用。精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，加入5% 亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4.00 mL，用30%的乙醇定容，摇匀，静置15 min，以试剂空白作参比，在波长510 nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标、芦丁含量为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:Y=1.1905X-0．0118 ，R2=0.9990，其中X代表吸光度，Y代表芦丁含量(mg)。

2.2.2 黄酮的提取及含量测定

称取1.00 g干燥国槐叶粉末，按一定料液比加入到不同醇水比和分相盐浓度配制的乙醇-硫酸铵双水相体系中，在一定温度和一定时间下超声提取，用分液漏斗分离，上相置于25 mL容量瓶中，并用70%的乙醇定容至刻度。根据标准曲线制作方法测定提取液的吸光度，通过回归方程计算提取液中黄酮含量。计算公式如下:

C:提取液中黄酮含量(mg)，V:总样品体积(mL)，W:样品重量(g)，V:测定样品体积(mL)N:稀释倍数。

2.3 试验设计

2.3.1 单因素试验

分别以超声提取温度、超声时间、料液比为影响因素，以黄酮含量为考察指标，以确定相关因素对国槐叶黄酮提取的影响。

2.3.2 BB试验设计及响应面分析

在单因素试验基础上，以影响国槐叶黄酮提取温度、超声时间、料液比3个因素为自变量，作3因素3水平的试验，因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken analysis

2.4 数据处理

本研究采用Excel 2003进行数据处理，Origin7.5软件作图，Design Expert8.0软件进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 温度对国槐叶黄酮含量的影响

准确称取样品1.00 g，置于乙醇-硫酸铵双水相体系中，在料液比为 1∶30，分别在 30、40、50、60、70℃的温度下，超声提取20 min，测定提取液中黄酮含量，结果如图1所示。从图1可以看出，随着超声提取温度的升高，黄酮含量增加，当超声温度超过40℃时，黄酮含量逐渐降低。超声温度低导致黄酮不能完全溶出，而温度升高，提取液黏度减小，扩散系数增加，促使提取速度加快，但是温度过高会造成溶剂的浪费，同时黄酮化合物分解，其次杂质大量溶出［11］，给后续的浓缩纯化增加难度，因此确定40℃为国槐叶黄酮提取最佳条件。

3.1.2 时间对国槐叶黄酮提取的影响

准确称取样品1.00 g，置于乙醇-硫酸铵双水相体系中，在温度为40℃，料液比为1∶30，分别超声提取 10、20、30、40、50、60 min，测定提取液中黄酮含量，结果见图2。从图2可以看出，黄酮含量在10～20 min时逐渐增高，而后随时间延长逐渐降低。其原因是超声时间过长会提高温度，对黄酮类化合物活性成分造成损失;另一方面提取时间较长，造成黄酮类化合物的氧化。因此综合分析，乙醇-硫酸铵双水相体系超声提取国槐叶黄酮以20 min为宜。

图1 温度对黄酮含量的影响Fig.1 Effects of temperature on contents of flavonoids flavonoids

图2 时间对黄酮含量的影响Fig.2 Effects of time on contents of flavonoids

图3 料液比对黄酮含量的影响Fig.3 Effects of liquid-to-material ratio on contents of flavonoids

3.1.3 料液比对国槐叶黄酮含量的影响

准确称取样品1.00 g，分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 置于乙醇-硫酸铵双水相体系中，在温度40℃，超声提取20 min，测定提取液中黄酮含量，结果如图3所示。从图3可以看出，黄酮含量随料液比的增大而缓慢增高，当料液比为1∶40时，黄酮含量达3.65%，在1∶50时黄酮含量为3.82%，从这个数据来看，再次增大料液比，黄酮溶出不显著。在植物细胞内，黄酮类化合物都是以苷键、酯键等疏水键与蛋白质、多糖等结合，要将黄酮浸出，首先溶剂要进入细胞内破坏疏水键。所以料液比较小，溶剂渗透并扩散到细胞内的速度以及黄酮化合物向溶剂中扩散的速度小，料液比太大，虽然有利于溶剂进入细胞内破坏疏水键，利于黄酮化合物向溶剂中扩散，但溶剂用量过大会造成分相盐用量增加，不仅耗费大量的溶剂和铵盐，也给后续处理带来不必要的麻烦。综合考虑，超声辅助双水相提取国槐叶黄酮的料液比选1∶40较为适宜。

3.2 BB试验设计及响应面分析

3.2.1 Box-Behnken试验结果与方差分析

在单因素试验的基础上，按照Box-Behnken中心组合试验方案进行3因素3水平试验，试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and results

将表2试验数据采用Design Expert8.0软件进行多元回归分析，得到国槐叶黄酮含量(Y)与温度(X1)、超声时间(X2)和料液比(X3)之间的函数关系:

为了说明回归方程的有效性及各因素对国槐叶黄酮含量影响的程度，对回归方程进行方差分析，结果见表3。

从表3可以看出，料液比的一次项对黄酮含量影响极显著(P＜0.01)，料液比二次项对黄酮含量影响较显著(P＜0.05)，其它项影响不显著。回归模型对黄酮含量影响较显著(P＜0.05)，失拟项检验(P＞0.05)不显著，说明未知因素对试验结果干扰小，模型成立，此模型的决定系数R2为89.00% ，表明方程拟合较好，能够较好的反映国槐叶黄酮含量与温度、超声提取时间和料液比之间的关系，各具体试验因子对响应面值的影响不是简单的线性关系，根据表3中F值的大小可以判断各因素对黄酮含量影响的强弱，F值越大，影响作用越强［11］。各个因素对黄酮含量影响大小的次序为:料液比＞超声时间＞超声温度，其中料液比对黄酮提取率的影响较大。

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

3.2.2 响应面分析与优化

响应面图能够比较直观的反映各因素之间的交互作用，通过多元回归方程做响应面及等高线图，结果见图4。

由图4A可知，黄酮含量随着温度和时间的增高而快速提高并趋于平稳。从等高线可以看出，等高线呈圆形，两者交互作用不显著，温度在0～0.5水平即温度在40～45℃之间，时间在0～0.5水平即20～25 min之间响应值较高，超过25 min，黄酮含量趋于平缓。

由图4B可知，黄酮含量随着料液比和温度的增大而增大，料液比曲面较陡，而温度的变化趋势比较平缓，说明料液比对黄酮含量影响较大。温度在0～0.5水平即温度在40～45℃之间，料液比在0.0～0.5水平即1∶30～1∶40之间响应值较高 。

由图4C可知，黄酮含量随着料液比和时间的增高而快速提高并趋于平稳，料液比曲面较陡，而时间的变化趋势比较平缓。时间在0.0～0.5水平即20～25 min之间，料液比在0.0～0.5水平即1∶30～1∶40之间黄酮含量较高，表明料液比对国槐叶黄酮的含量有显著的影响。

图4 各因素对黄酮含量影响的响应面图Fig.4 Response surface plots of effect of various factors on flavonoids

3.3 最佳工艺确定及验证试验

通过Design Expert8.0软件对回归方程进行分析，得到超声辅助双水相提取国槐叶黄酮的最佳工艺，经模型优化最佳条件编码值:X1为0.148、X2为0.081、X3为0.493，即提取温度为41.48℃、时间为20.81 min、料液比为1∶39.86。考虑到实际试验的可操作性，将最佳工艺调整为超声时间21 min，温度取41℃，液料比取1∶40，预测得国槐叶黄酮含量为3.94%。

对优化的提取工艺进行验证试验，结果如表4。优化工艺测得黄酮含量为3.84%，相对标准偏差为1.19%，模型预测值为3.94%，实测值与预测值非常接近，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，证实了该模型的有效性。同时也说明了响应面分析法适用于超声辅助双水相体系提取国槐叶黄酮参数的优化。

表4 最佳工艺条件验证结果(n=5)Table 4 Validation results of optimal extraction conditions(n=5)

4 结论

4.1 本研究通过单因素试验和Box-Behnken中心组合设计及响应面分析，研究了超声辅助双水相体系提取国槐叶黄酮的最佳工艺。结果表明，在乙醇质量分数为30%，硫酸铵为20%的双水相体系中，国槐叶黄酮提取的最优条件为:超声温度41℃、超声时间21 min、料液比1∶40，实测值为3.84%，模型预测值为3.94%，实测值与预测值非常接近，证实了该模型的有效性。该方法与常规提取相比较，提取时间短、试剂用量少、黄酮提取率高，提取温度低有利于热敏成分的保持，在生物活性成分的提取分离领域展现了良好的应用前景。但是对于国槐叶黄酮物质的分离、纯化鉴定以及化学性质等问题有待进一步研究。

4.2 本研究利用超声辅助双水相体系对国槐叶黄酮含量进行提取与测定，测得黄酮含量达3.84%即38.40 mg/g，高于文献［12］所报道的提取量(26.20 mg/g)。从实验结果来看，国槐叶黄酮含量较高，从材料本身和药用成本考虑，选取材料附加值更高，国槐资源丰富，材料易得，废弃资源得到了有效的利用;其次填补了黄酮提取材料不足等问题，综上考虑，综合效益可观，有开发利用价值。

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