人心肌干细胞的体外改良培养*

胡圣大, 马根山, 姚玉宇, 陈中璞, 严凤娣

(东南大学附属中大医院心内科, 江苏 南京 210009)

·实验技术·

人心肌干细胞的体外改良培养*

胡圣大, 马根山△, 姚玉宇, 陈中璞, 严凤娣

(东南大学附属中大医院心内科, 江苏 南京 210009)

目的用改良的培养基培养人心肌干细胞，并筛选鉴定。方法通过心脏外科手术取下右心耳组织，用组织块培养法来获得原代心肌干细胞，用改良的心肌干细胞培养液培养，增殖传代后进行心肌干细胞表面标志物的鉴定，再用免疫磁珠筛选以获得较纯的目的心肌干细胞。结果培养约2周后，贴壁良好的心肌组织块周围可见有小、圆、亮的细胞爬出，用Accutase(细胞消化液)短时间消化后冲洗细胞，培养增殖传代，其增殖能力与传统心肌干细胞培养液培养的细胞比较无显著差异，用流式细胞术鉴定c-Kit(干细胞表面标志物)，其阳性率(6.8±2.1)%，之后用含抗c-Kit抗体(anti-c-Kit)的磁珠进行分选，即得较纯的c-Kit阳性(c-Kit+)心肌干细胞,它们可以分化为心肌细胞。结论通过心脏组织块贴壁培养法，用改良后的心肌干细胞培养基培养，再借助免疫磁珠的分选，同样可得到较纯的c-Kit+心肌干细胞。

心肌干细胞； 流式细胞术； 磁珠分选

一直以来的传统观念都认为哺乳动物的心脏是终末分化器官，心肌细胞是永久性细胞(正常情况下心肌细胞的寿命与个体寿命相同，不能分裂增殖)。伴随着疾病和衰老，部分成年心肌细胞丢失，只能通过剩余心肌细胞的肥大和结缔组织的增生纤维化来进行重构代偿。然而，近年来这一观点正逐渐被动摇，认为成年心脏虽是终末器官，但心肌组织中含有可以再生的细胞，称之为心肌干细胞，它可以分化为心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞[1]。在人的一生中，成年心肌细胞不停地衰老死亡，同时由心肌干细胞不断增殖分化为新的心肌细胞，维持心肌细胞数目的动态平衡，保持心脏功能[2-3]。

病理情况下心肌细胞的丢失量超过其增殖代偿能力，便会出现前述传统观念的变化，因此如何进一步促进心肌干细胞的增殖归巢分化便成为当前研究的热点。而这些研究的基础在于心肌干细胞的培养获得，本研究旨在探索一条简便实用的培养方法，为心肌干细胞的进一步研究打下基础。

材 料 和 方 法

1材料

Trypsin和collagenaseⅣ粉剂购自Biosharp;Accutase购自Millipore;无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素链霉素双抗、IMDM和DMEM/F12培养液均购自HyClone;β-巯基乙醇购自Sunshine;血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购自Sigma;anti-c-Kit microbeads和anti-c-Kit-PE购自Miltenyi Biotec；恒温细胞培养箱购自Thermo；恒温振荡仪购自太仓市科教器材厂。

2方法

2.1取材和培养 心脏外科手术过程中(患者年龄2～72岁；心脏疾病有：冠心病、瓣膜病和先心病)，在情况许可的条件下，取右心耳组织数克。用不含钙、镁的无菌PBS冲洗掉血液，去掉脂肪组织后剪成大小1 mm×1 mm ×1 mm 左右的小块，然后移入离心管加入适量0.2%胰蛋白酶和0.1%胶原酶IV的混合液，37 ℃振荡消化5 min，移去消化液，重复3次。处理后的组织块用完全组织块培养液(complete explant medium，CEM;以IMDM为基础，含20%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素和0.1 mmol/L β-巯基乙醇)冲洗1～2次后移入到6孔板中并使其均匀分散。加入少量CEM(约0.5 mL左右)，保持组织块湿润即可，置于37 ℃、含5%CO2的恒温培养箱中贴壁。8～12 h后加入1～1.5 mL的CEM，继续前述条件培养，2～3 d换1次培养液。

2.2心肌干细胞的收集培养 通常3～7 d的时间内，贴壁良好的心肌组织块周围可见到先有长梭形的成纤维细胞爬出，之后数天即可见在其上面爬出的小、圆、亮的细胞，当有较多的此类细胞时，即用Accutase消化(约2 min即可)，之后加入少量改良的心肌干细胞培养液(improved cardiosphere-growing medium，improved CGM;以DMEM/F12为基础,含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素和0.1 mmol/L β-巯基乙醇，较之传统的CGM，减少了VEGF和bFGF 2种细胞因子)，轻柔地冲洗数次，将冲洗后的混合液移入6 cm的培养皿中培养，置于37 ℃、含5%CO2的恒温培养箱继续培养传代增殖，2～3 d换1次培养液。

2.3心肌干细胞的鉴定及纯化 待3～6 d后，培养皿中的细胞基本上生长融合，且为单层细胞，用Accutase消化3～5 min，取适量样品，加入anti-c-Kit-PE孵育后行流式细胞术分析，剩余细胞用anti-c-Kit抗体吸附的磁珠进行分选[4-5]，即可得到较多较纯的c-Kit+心肌干细胞。

2.4心肌干细胞的增殖和分化测定 利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)来测定细胞增殖能力，细胞接种于96孔板，每孔约3×103细胞，分别用传统的CGM和不含VEGF和bFGF的CGM进行培养，3 d后各16个孔在450 nm处测定A值，所得数据间接表示细胞的量，所有步骤严格按试剂盒说明进行。开胸结扎前降支制作裸鼠心梗模型后，经心外膜注射心肌干细胞，4周后取心肌组织进行组织免疫荧光染色鉴定心肌干细胞的分化情况。

3统计学处理

采用SPSS 18.0软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用t检验。

结 果

1组织块的培养

贴壁好的组织块周围，早的3 d后即可看见周围有梭形的成纤维细胞爬出，最晚的1周左右也可以爬出，否则通常不再会有细胞爬出。成纤维细胞爬出后3 d左右在其上面即可以出现小、圆、亮的细胞，以后逐渐增多,见图1。

Figure 1. Primary cardiac stem cells cultured from tissue blocks (×100). Lower left corner: myocardial tissue blocks.The arrows show small, round and bright primary cardiac stem cells,while the triangles refer to the fibroblasts.

图1组织块培养的原代心肌干细胞

2心肌干细胞的获得、培养及纯化鉴定

待小、圆、亮的细胞出现较多后即可消化冲洗下来移入培养皿培养增殖，此时部分心肌干细胞贴壁后空间不受约束，胞质会向外伸展而形成梭形、多边形或不规则异形等形状,见图2。不同年龄及疾病患者细胞的c-Kit阳性率是不一样的，总体上未分选细胞c-Kit的阳性率约2%～18%(6.8%±2.1%),见图3。经磁珠分选后即可得到一定量的较纯的c-Kit+心肌干细胞，c-Kit阳性率可超过80%。所得细胞可于-80 ℃较长时间保存(更长时间保存应保存于液氮中)，且复苏后仍具有干细胞活力。

3心肌干细胞的增殖和分化

利用CCK-8法我们测定了细胞的增殖能力，均直接用A值表示细胞的量，传统CGM培养组和不含VEGF及bFGF的CGM组A值分别是0.156±0.013和0.149±0.011，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。体内心肌干细胞的分化实验明确其可以分化为心肌细胞,见图4。

Figure 2. The second generation of cardiac stem cells (×200).

图2传至第2代的呈球形的心肌干细胞

Figure 3. Flow cytometric identification of cardiac stem cells.A: control; B: labeled with anti-c-Kit-PE flow cytometry antibody and the c-Kit positive rate was 8.44%.

图3消化下的第2代心肌干细胞的流式细胞术鉴定

Figure 4. Identification of the differentiation of cardiac stem cells using tissue immunofluorescence technique (×200). Red fluorescence shows staining of myocyte cytoplasm by sarcomeric α-actin antibody; blue fluorescence shows nuclei; green fluorescence shows localization of mitochondria.

图4心肌干细胞的分化鉴定

讨 论

常用于鉴定心肌干细胞的表面标记有c-Kit、isl1和Sca-1等[6-8]，本实验室测得Sca-1阳性的细胞数比例仅1.4%(由于市面上暂无用于测人干细胞的Sca-1，考虑到可能的交叉反应，遂试用抗小鼠的anti-Sca-1，同时测得小鼠心肌干细胞的Sca-1阳性率1.8%，较之人无显著差异)。而用anti-isl1则几乎无阳性表达，加之文献报道认为从人心肌组织中分离的c-Kit+细胞即为心肌干细胞[6]，故我们实验室最终确定选定c-Kit为心肌干细胞的待测表面标志。

本研究采用Messina等[9]的组织块培养法获取原代细胞，该方法避免了长时间多次酶消化对细胞造成的损伤，在大大减少了杂细胞的同时也最大限度地使用了心肌组织块，可以反复多次地从组织块周围消化下所需的细胞。对于小、圆、亮的细胞采用Accutase短时间消化后用改良的CGM轻柔冲洗2～3次，用力较大则会将组织块冲下，其获取细胞的效率比Tang等[10]报道的D-Hanks液冲洗法要高很多，而且Accutase作用较温和，对所得细胞的活性及表面标志影响均不大，c-Kit的阳性率与国外文献报道的一致[1]。本实验室前期的细胞培养液CGM中均加入了EGF和bFGF，在本研究的细胞培养中，我们尝试着使用未加EGF和bFGF的改良CGM，发现细胞的增殖活力在通常情况下并没有发生明显的改变，用于培养细胞的培养皿3～6 d即需传代分瓶，之后的流式细胞术分析鉴定c-Kit的阳性率没有明显的差异[1]。

实验中还有几个关键点：首先是组织块的初次加液量与贴壁时间的掌握，时间短加液过多均导致组织块未贴壁好，细胞无法爬出，时间久加液少，培养液干涸组织块细胞死亡；其次是初次消化细胞时间的掌握，过短细胞消化不下来，过久会消化下贴壁较牢的成纤维细胞，致使杂细胞过多，为后续的实验增加工作量，甚至影响心肌干细胞的增殖分化。由于所得原代细胞数量较少(若是单用D-Hanks冲洗，所得细胞数量更少)，若直接用磁珠分选细胞，首先会浪费磁柱的利用率；其次加之操作过程中丢失及破坏的细胞，最后所得目的细胞已所剩无几。故而本实验室在取得原代细胞后，先经3～6 d的增殖后再进行磁珠分选，得到目的细胞的数量大大增加。

总之，本实验室采用组织块贴壁培养法，成功地获得原代心肌干细胞后，未加EGF和bFGF的改良细胞培养液也成功地运用于心肌干细胞的培养，这种改良的细胞培养液对干细胞的增殖分化能力及c-Kit的表达未产生明显的影响，但却大大减少了细胞培养的实验费用。培养获得的心肌干细胞可用于进一步的研究，以期最终能够解决临床问题。

(致谢:感谢东南大学附属中大医院心胸外科刘志勇教授和何伟博士提供的人心肌组织块！)

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Cultureofhumancardiacstemcellswithimprovedcardiosphere-growingmediuminvitro

HU Sheng-da, MA Gen-shan, YAO Yu-yu, CHEN Zhong-pu, YAN Feng-di

(DepartmentofCardiology,theAffiliatedZhongdaHospitalofSoutheastUniversity,Nanjing210009,China.E-mail:magenshan@hotmail.com)

AIM: To prepare an improved medium for culturing human cardiac stem cells.METHODSThe heart samples of the right auricle obtained from the patients after cardiac surgery were minced into pieces (about 1 mm×1 mm×1 mm), digested and cultured. The primary cells obtained were cultured with improved cardiosphere-growing medium (CGM) for proliferation, and the cells were identified by flow cytometry. Finally, purer c-kit+cells were obtained by the method of magnetic bead sorting.RESULTSAfter about 2 weeks of culture, small, round and phase-bright cells migrated from the well-adherent explants over a layer of fibroblast-like cells. These cells were collected by a brief digestion with Accutase, washed and cultured with improved CGM. No significant difference of the proliferative capacity between using traditional CGM and improved CGM was observed. After subculture and proliferation, the identification result by flow cytometry showed that the positive rate of c-Kit surface marker on these cells was (6.8±2.1)%. By the method of anti-c-Kit magnetic bead sorting, purer c-Kit+cardiac stem cells were obtained and differentiated into cardiomyocytes.CONCLUSIONPurer c-Kit+cardiac stem cells are isolated with the improved CGM culture.

Cardiac stem cells; Flow cytometry; Magnetic bead sorting

R542.2+2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.035

1000- 4718(2013)02- 0381- 04

2012-07-03

2012-12-27

国家自然科学基金资助项目(No.6590000029)

△通讯作者Tel： 025-83272038； E-mail: magenshan@hotmail.com