Ras-MAPK通路在食管癌中的研究进展*

昌毓穗， 刘季春△， 傅华群， 喻本桐， 徐建军， 王一明， 魏益平， 邹书兵

(南昌大学 1第一附属医院胸心血管外科， 2第二附属医院普外科，3第二附属医院胸心血管外科，江西 南昌 330006)

Ras-MAPK通路在食管癌中的研究进展*

昌毓穗1， 刘季春1△， 傅华群2△， 喻本桐1， 徐建军3， 王一明3， 魏益平3， 邹书兵2

(南昌大学1第一附属医院胸心血管外科，2第二附属医院普外科，3第二附属医院胸心血管外科，江西 南昌 330006)

Ras蛋白是调节细胞生长和增殖信号通路的重要元件。当Ras变异时，将信号转导到下游信号元件可能引起细胞的异常增殖, 导致肿瘤发生。抑制Ras及其下游信号可抑制细胞增殖[1]和促进肿瘤细胞凋亡[2],研究表明Ras信号通路在食管肿瘤的发病过程中起着重要作用[3]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是Ras下游的一个主要通路，其主导的促有丝分裂和抗凋亡信号在人恶性肿瘤细胞的生长和预后中扮演重要角色。近年来研究发现MAPK信号转导通路在食管癌中表达失调[4]。本文就Ras-MAPK通路在食管癌中的研究进展作一综述。

1 ras基因定位及Ras蛋白的结构和生物学功能

1.1ras基因定位ras基因包括3个主要类型:N-ras、H-ras和K-ras, 它们分别定位于1、11和12 号染色体。ras基因都含有4个编码的外显子和1个5’末端非编码外显子, 能编码出4种Ras蛋白:即H-Ras、N-Ras、K-RasA 和K-RasB。

1.2Ras蛋白的结构和生物学功能 K-RasB含188个氨基酸, 其它Ras蛋白均含有189个氨基酸。Ras蛋白的氨基酸序列高度保守, 同源性达85%。这些高度保守的结构域包含鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)及效应因子的结合域,对于蛋白功能的发挥起着极为重要的作用。Ras蛋白有一个特殊的氨基酸结构域, 即羧基末端的CAAX模块(C为半胱氨酸, A为脂肪族氨基酸, X为任意氨基酸),见图1。

Figure 1. Amino acid sequences of partial regions in Ras proteins.Ⅰis the region where the guanylic acid connected to; Ⅱ is the region where the effectors/GAP act on; Ⅲ is the region where GEF act on. The black area is a highly variable region; the pink region is CAAX tetrapeptide motif where C is cysteine, A is aliphatic amino acid and X is terminal amino acid. All the Ras proteins have 189 amino acids except the K-RasB which is composed of 188 amino acids.

图1Ras蛋白部分区域氨基酸序列图

Ras蛋白的晶体结构表明它以鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate,GDP)结合(Ras-GDP)和GTP结合(Ras-GTP)2种形式存在。当Ras蛋白与GDP结合,为失活状态；与GTP结合,为活化状态，见图2。

Ras蛋白是调节细胞生长和增殖的信号通路的重要元件。当Ras变异时，Ras持续处于活化状态, 可与下游的效应蛋白结合, 将信号转导到下游信号元件, 可能引起细胞的异常增殖, 导致肿瘤的发生。尽管点突变影响Ras的阅读框可导致各种与野生型不一样的致瘤等位基因，但氨基酸替换常发生在第12位残基，同时也相对较少地见于第13和第61位残基[5]。

2 MAPK通路

MAPK通过使各种转录因子的丝氨酸/苏氨酸磷酸化从而活化各种转录因子。MAPK通路分为3种，它们分别是：(1)胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路；(2)p38 MAPK通路；(3)JNK/SAPK通路，即c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路，又被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)通路。

MAPK通路是Ras下游的一个主要通路，近年来研究发现MAPK信号转导通路在包括食管癌在内的多种人类肿瘤中表达失调[6- 7]。

3 Ras-MAPK信号通路与食管癌

有人通过对食管癌组织及食管正常组织的对比实验发现食管癌中存在Ras变异，而正常组织中未发现此现象，吸烟和酗酒可使Ras 第12位密码子变异而致癌[3]。Ras变异在食管腺癌中为21%，而在高高级别瘤变中只有11%；在低级别瘤变中及正常食道黏膜中未检测到Ras突变[8]。这说明在癌变的不同阶段，Ras变异表达程度亦不同。并且，当Ras异常时常伴有MAPK的异常。针对该信号通路中不同靶位点的研究，可为食管癌发病机制的阐明及治疗提供有益的理论基础。

Figure 2. The activation and inactivation switch of Ras protein.GEF: guanine nucleotide exchange factor; GAP: GTPase-activating protein; E: effector; P: phosphate; A: activation; I: inactivation.

图2Ras蛋白活化与失活转变图

3.1Ras/Raf/MEK/ERK 这条信号通路是目前研究得最多和最详细的一条通路，也是最经典的一条信号通路。在这条通路中，由于Ras的异常活化，从而激活其下游靶标Raf，而活化的Raf使下游的丝裂原细胞外激酶(mitogen extracellular kinase，MEK)磷酸化而被激活，最终激活ERK。

在食管腺癌中有11%具有活化的变异型B-Raf，在高级别上皮瘤变的Barrett’s食管中只有4%具有活化的变异型B-Raf[8]，说明在B-Raf的表达可能与食管癌的发生及恶性程度相关。食管腺癌和鳞癌中Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)的表达均明显下降，有人通过检测食管癌组织标本发现RKIP的表达与组织学级别、病理T分期、淋巴侵袭、区域淋巴结转移呈负相关，并且RKIP表达下降的食管癌病人，其术后生存期也明显缩短[9-11]。因此，通过对Raf这一靶位点的干预，可能降低食管癌的发生或恶性程度。

RKIP是Ras-MAPK激酶信号通路的内源性抑制剂，主要调节机制是通过RKIP与Raf激酶区域相互作用从而抑制MAPK信号通路的活性。作为MEK磷酸化的竞争性抑制剂，RKIP能有效分离RAF/MEK复合物。而索拉菲尼，一种口服的Raf抑制剂，能够抑制ERK的活化，明显抑制癌细胞的生长[12]。

Ras的活化与MEK磷酸化也是一致的，当MEK被抑制剂抑制时，ERK的活性也丧失。MEK磷酸化ERK，进而活化下游因子[13]。ERK与食管癌侵袭性的表型有关，有人通过单变量及多变量统计分析发现食管癌细胞核及胞浆中磷酸化ERK表达增多及染色增强与肿瘤级别呈显著相关性[4]。

人食管癌肿瘤微环境可诱导未成熟树突细胞向内皮细胞分化，成为内皮样细胞，但对成熟的树突细胞无明显影响。在未成熟的树突细胞向内皮样细胞分化过程中，存在着ERK1/2的持续活化[14]。表明ERK1/2信号通道的活化能介导食管癌微环境中未成熟树突细胞内皮样分化。实验还发现，ERK对于c-Myc蛋白第62位的丝氨酸磷酸化起着重要的作用，从而增加c-Myc蛋白的稳定性和细胞核内的积聚[15]。而c-Myc是一种致瘤性转录因子，通常在恶性疾病中处于上调状态。

有实验表明ERK2在食管癌中比ERK1更重要[16]。食管癌细胞转染shRNA-ERK2质粒后，其生长与对照组比较明显受到抑制，ERK2的表达明显下降，细胞周期停止在G1期[17]。表明ERK2在食管癌细胞的生长中起了重要的促进作用。

此外，研究表明，Ras-MAPK通路的活化与食管癌产生抗肿瘤药物的耐药相关[18]。新的1型胰岛素样生长因子受体抑制剂能强而有力地抑制Akt(即蛋白激酶B，protein kinase B，PKB)和胰岛素样生长因子受体的活性，但不能抑制MEK和ERK的活性，从而导致食管癌对其不敏感。说明由于Ras-MAPK活性的维持使得食管癌对该抑制剂不敏感。

3.2Ras/MKK/p38 Estrada等[19]报道N-Ras或B-Raf的变异能高度活化p38 MAPK。而p38 MAPK与肿瘤发生的关系目前观点不一。

有研究表明p38 MAPK抑制肿瘤形成。将细胞用p38的特异性阻断剂预处理后，能抑制p38 MAPK的活化，从而减弱人胃癌细胞中桔梗皂甙D诱导的细胞凋亡，这表明p38 MAPK的活化是诱导细胞凋亡的主要原因[20]。同样，在子宫内膜癌细胞中，p38 MAPK的活化可导致癌细胞的凋亡从而抑制癌细胞的增殖[21]。在人早幼粒细胞白血病细胞HL-60中，p38 MAPK特异性抑制剂能抑制抗癌药物降低Bcl-xL水平的作用，从而阻断抗癌药物诱导的细胞凋亡[22]。

相反，有研究发现p38 MAPK促进肿瘤增殖及通过调节血管形成促进肿瘤转移和细胞的侵袭。在胃癌细胞中，活化的p38 MAPK能介导诱生性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表达；当p38 MAPK被特异性抑制剂抑制时，VEGF和COX-2的表达也被抑制[23]。在肝癌细胞中，过高表达的纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2，FGL2)可诱导p38 MAPK的磷酸化而使蛋白酶活化受体激活，而敲除FGL2表达的肝癌细胞可导致移植肿瘤在42 d的观察期中生长延迟及血管生成下降[24]。这说明FGL2通过下游的p38 MAPK起着促瘤作用。有实验证实，抑制p38 MAPK可保护腹膜腔腺癌模型鼠抗胃癌细胞扩散。给予p38特异性抑制剂，可减弱经腹膜腔接种胃癌细胞而诱导的肿瘤中心的形成；并且抑制p38 MAPK可增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性及与多耐药蛋白-1表达的下调相关[7]。总之，p38 MAPK通路在增加癌细胞的侵袭表型中发挥重要作用。

伐地考昔通过活化p38 MAPK通路而上调Fas和FasL蛋白，进而使食管癌细胞凋亡率增加；当用p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580阻断时，食管癌细胞的凋亡率下降[25]。硼替佐米活化p38 MAPK，诱导食管癌细胞G2/M周期时相的终止及与caspase裂解相关的依赖p38 MAPK的凋亡，不管是用小干扰RNA还是用药物抑制剂阻断p38 MAPK，都能阻断硼替佐米诱导的凋亡[26]。在食管腺癌中也发现，p38 MAPK通路的活化可引起细胞凋亡和细胞周期停止[27]。这表明不管是在食管磷癌还是腺癌中，p38 MAPK均可通过促进癌细胞凋亡而发挥抑瘤作用。

然而也有证据证明p38 MAPK在食管癌中具有促瘤作用。中心体相关蛋白A(Aurora-A)通过p38 MAPK通路使食管癌向恶性方向发展而增加肿瘤的侵袭力，当Aurora-A过高表达时使p38 MAPK的磷酸化水平增加，而用反义RNA敲除Aurora-A则p38 MAPK的活性也下降[28]。这表明p38 MAPK促进食管癌的发展。研究表明，低剂量阿斯匹林是通过阻止增殖和抗凋亡激酶p38 MAPK的活化而减轻食管返流诱发的食管组织学改变[29]。在食管腺癌细胞中，去氧胆酸通过活化p38 MAPK来介导抗凋亡蛋白的活化[30]。索匪拉尼能够抑制酸和胆汁酸引起的磷酸化p38 MAPK的增加，从而抑制腺癌细胞的生长[12]。上述研究表明，p38 MAPK不管是在食管磷癌还是腺癌中都促进肿瘤增殖及细胞的侵袭。

有趣的是，有人发现在食管癌细胞体外培养实验中，p38 MAPK的选择性抑制剂可呈剂量和时间依赖性地抑制食管癌细胞生长，说明食管癌细胞的生长和增殖与磷酸化p38 MAPK密切相关；而通过外科手术切除标本的研究却发现，食管癌旁无瘤组织中磷酸化的p38 MAPK比癌组织明显增高，但磷酸化p38 MAPK的表达与淋巴结转移和癌分化程度无明显相关性。据此认为，磷酸化p38 MAPK在肿瘤的不同阶段起着多面性作用，体外培养的癌细胞为成瘤后阶段，磷酸化p38 MAPK的功能为促进癌细胞生长；而癌旁组织是成瘤前阶段，磷酸化p38 MAPK起着抑瘤基因的作用[31]。这表明p38 MAPK在肿瘤中的作用可能因细胞或组织类型及肿瘤特殊阶段的不同而异。

3.3Ras/JNK/SAPK JNK在不同的组织和细胞类型中作用不同。有人发现，JNK通路的激活可通过增加caspase-3的表达而促进大鼠脑缺血再灌注海马神经元凋亡[32]。在食管癌中，JNK的活化可使食管磷癌细胞凋亡[26]。通过体内外对食管癌细胞不同的亚细胞结构进行靶向抑制发现，肿瘤的生长抑制与内质网上JNK的磷酸化呈正相关，并且通过诱导细胞凋亡而使细胞死亡[33]。

相反，有研究显示，通过抑制缺氧诱导的JNK磷酸化，可抑制食管癌细胞增殖及下调VEGF在食管癌中的表达[34]。这表明JNK的磷酸化与食管癌细胞增殖及VEGF的表达可能存在正相关性，对于食管肿瘤的增长和血管形成有促进作用。此外，通过细胞迁移、侵袭及细胞划痕实验表明，抑制JNK通路能明显地抑制食管癌细胞侵袭性表型[35]。由此可见，JNK在食管癌中可能也存在着多面性作用，其具体的作用环节和机制还有待更多的研究来进一步阐明。

[1] 龙向淑，吴 强，宋 方．干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制[J]．中国病理生理杂志，2012，28(6)：1018-1022．

[2] 李尊岭，邵淑红，焦 飞，等．K-ras反义核酸抑制肺腺癌细胞A549的生长[J]．中国病理生理杂志，2011，27(11)：2096-2100．

[3] Lyronis ID, Baritaki S, Bizakis I, et al. K-ras mutation, HPV infection and smoking or alcohol abuse positively correlate with esophageal squamous carcinoma[J]. Pathol Oncol Res, 2008, 14(3):267-273.

[4] Tasioudi KE, Saetta AA, Sakellariou S, et al. pERK activation in esophageal carcinomas: clinicopathological associations[J]. Pathol Res Pract, 2012, 208(7): 398-404.

[5] Baines AT, Xu D, Der CJ. Inhibition of Ras for cancer treatment: the search continues[J]. Future Med Chem, 2011, 3(14):1787-1808.

[6] 孙晓东，刘杏娥．姜黄素通过抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信号诱导胰腺癌细胞凋亡[J]．中国病理生理杂志，2012，28(6)：996-1000．

[7] Graziosi L, Mencarelli A, Santorelli C, et al. Mechanistic role of p38 MAPK in gastric cancer dissemination in a rodent model peritoneal metastasis[J]. Eur J Pharmacol, 2012, 674(2-3):143-152.

[8] Sommerer F, Vieth M, Markwarth A, et al. Mutations of BRAF and KRAS2 in the development of Barrett’s adenocarcinoma[J]. Oncogene, 2004, 23(2):554- 558.

[9] Birner P, Jesch B, Schultheis A, et al. RAF-kinase inhibitor protein (RKIP) downregulation in esophageal cancer and its metastases[J]. Clin Exp Metastasis, 2012, 29(6):551-559.

[10] Gao C, Pang L, Ren C, et al. Prognostic value of raf kinase inhibitor protein in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Pathol Oncol Res, 2012, 18(2):471- 477.

[11] Kim HS, Won KY, Kim GY, et al. Reduced expression of Raf-1 kinase inhibitory protein predicts regional lymph node metastasis and shorter survival in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Pathol Res Pract, 2012, 208(5):292- 299.

[12] Keswani RN, Chumsangsri A, Mustafi R, et al. Sorafenib inhibits MAPK- mediated proliferation in a Barrett’s esophageal adenocarcinoma cell line[J]. Dis Esophagus, 2008, 21(6):514-521.

[13] Gao SY, Li EM, Cui L, et al. Sp1 and AP-1 regulate expression of the human gene VIL2 in esophageal carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2009, 284(12):7995- 8004.

[14] Lu J, Zhao J, Liu K, et al. MAPK/ERK1/2 signaling mediates endothelial-like differentiation of immature DCs in the microenvironment of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cell Mol Life Sci, 2010, 67(12):2091-2106.

[15] Yu L, Wu WK, Li ZJ, et al. Prostaglandin E(2) promotes cell proliferation via protein kinase C/extracellular signal regulated kinase pathway-dependent induction of c-Myc expression in human esophageal squamous cell carcinoma cells[J]. Int J Cancer, 2009, 125(11):2540-2546.

[16] Zheng ST, Huo Q, Tuerxun A, et al. The expression and activation of ERK/MAPK pathway in human esophageal cancer cell line EC9706[J]. Mol Biol Rep, 2011, 38(2):865-872.

[17] Huo Q, Zheng ST, Tuersun A, et al. shRNA interference for extracellular signal-regulated kinase 2 can inhibit the growth of esophageal cancer cell line Eca109[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2010, 30(3):170-177.

[18] Bao XH, Takaoka M, Hao HF, et al. Esophageal cancer exhibits resistance to a novel IGF-1R inhibitor NVP-AEW541 with maintained RAS-MAPK activity[J]. Anticancer Res, 2012, 32(7):2827-2834.

[19] Estrada Y, Dong J, Ossowski L. Positive crosstalk between ERK and p38 in melanoma stimulates migration andinvivoproliferation[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2009, 22(1):66-76.

[20] Chun J, Joo EJ, Kang M, et al. Platycodin D induces anoikis and caspase-mediated apoptosis via p38 MAPK in AGS human gastric cancer cells[J]. J Cell Biochem, 2013, 114(2): 456- 470.

[21] Manohar M, Fatima I, Saxena R, et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate induces apoptosis in human endometrial adenocarcinoma cells via ROS generation and p38 MAP kinase activation[J]. J Nutr Biochem, 2012, Sep 5. [Epub ahead of print]

[22] Kim KN, Ham YM, Moon JY, et al. Acanthoic acid induces cell apoptosis through activation of the p38 MAPK pathway in HL-60 human promyelocytic leukaemia[J]. Food Chem, 2012, 135(3):2112-2117.

[23] Zhang C, Gao GR, Lv CG, et al. Protease-activated receptor-2 induces expression of vascular endothelial growth factor and cyclooxygenase-2 via the mitogen-activated protein kinase pathway in gastric cancer cells[J]. Oncol Rep, 2012, 28(5):1917-1923.

[24] Liu Y, Xu L, Zeng Q, et al. Downregulation of FGL2/prothrombinase delays HCCLM6 xenograft tumour growth and decreases tumour angiogenesis[J]. Liver Int, 2012, 32(10):1585-1595.

[25] Liu SX, Zhang YJ, Guo HF, et al. The regulatory effect of the p38 signaling pathway on valdecoxib-induced apoptosis of the Eca109 cell line[J]. Oncol Rep, 2009, 22(2):313-319.

[26] Lioni M, Noma K, Snyder A, et al. Bortezomib induces apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells through activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(9):2866-2875.

[27] Sutter AP, Maaser K, Barthel B, et al. Ligands of the peripheral benzodiazepine receptor induce apoptosis and cell cycle arrest in oesophageal cancer cells: involvement of the p38MAPK signalling pathway[J]. Br J Cancer, 2003, 89(3): 564-572.

[28] Wang X, Lu N, Niu B, et al. Overexpression of Aurora-A enhances invasion and matrix metalloproteinase-2 expression in esophageal squamous cell carcinoma cells[J]. Mol Cancer Res, 2012, 10(5):588-596.

[29] Selvan B, Ramachandran A, Korula A, et al. Low dose aspirin prevents duodenoesophageal reflux induced mucosal changes in Wistar rat esophagus by MAP kinase mediated pathways[J]. Int J Surg, 2012, 10(2):73-79.

[30] Looby E, Abdel-Latif MM, Athie-Morales V, et al. Deoxycholate induces COX-2 expression via Erk1/2-, p38-MAPK and AP-1-dependent mechanisms in esophageal cancer cells[J]. BMC Cancer, 2009, 9:190.

[31] Zheng ST, Zhang CS, Qin X, et al. The status of phosphorylated p38 in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(5):5315-5321.

[32] 张 霞，钱 涛，高维娟，等．JNK通路促进大鼠脑缺血再灌注海马神经元凋亡[J]．中国病理生理杂志，2012，28(8)：1431-1435．

[33] Pataer A, Hu W, Lu X, et al. Adenoviral endoplasmic reticulum-targeted mda-7/interleukin-24 vector enhances human cancer cell killing[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(8):2528-2535.

[34] Chen QJ, Zhang MZ, Wang LX. Gensenoside Rg3 inhibits hypoxia-induced VEGF expression in human cancer cells[J]. Cell Physiol Biochem, 2010, 26(6): 849-858.

[35] Onwuegbusi BA, Rees JR, Lao-Sirieix P, et al. Selective loss of TGFβ Smad-dependent signalling prevents cell cycle arrest and promotes invasion in oesophageal adenocarcinoma cell lines[J]. PLoS One, 2007, 2(1):e177.

RolesofRas-MAPKsignalingpathwaysinesophagealcarcinoma

CHANG Yu-sui1, LIU Ji-chun1, FU Hua-qun2, YU Ben-tong1, XU Jian-jun3, WANG Yi-ming3, WEI Yi-ping3, ZOU Shu-bing2

(1DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofGeneralSurgery,theSecondAffiliatedHospital,3DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,theSecondAffiliatedHospitalNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:cyscys2005@126.com;zgblslzz2005@126.com)

Ras is best known for the ability of regulating cell growth, proliferation and differentiation. Mutations in Ras are associated with abnormal cell proliferation, resulting in the incidence of all human cancers. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways are the most well described pathways in carcinogenesis, which has been identified as a key downstream effector in Ras signaling as well as playing important roles in prognosis of tumors. Recently, evidence has gradually accumulated to demonstrate that mutation in Ras or aberrant expression of MAPK has profound effects on the incidence of esophageal carcinoma, and applications of some chemotherapeutic drugs can not lead to the expectant function. Further understanding of the relevant molecular mechanisms of Ras-MAPK signaling pathways will be helpful for development of efficient targeting therapeutic approaches to the treatment of esophageal cancer. In this article, the advances of Ras-MAPK signaling pathways in esophageal carcinoma are reviewed.

食管肿瘤； Ras蛋白； 有丝分裂原活化蛋白激酶类； 信号通路

Esophageal neoplasms; Ras protein; Mitogen-activated protein kinases; Signaling pathway

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.034

1000- 4718(2013)02- 0376- 05

2012- 10- 16

2012- 12- 13

江西省卫生厅科技计划基金资助项目(No.20113055)

△通讯作者 刘季春Tel： 0791-88692707； E-mail: cyscys2005@126.com； 傅华群Tel： 0791-86312380； E-mail:zgblslzz2005@126.com