雷奈酸锶通过TGF-β1/Smad通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化*

黄晓丹，吕辉珍，靳思思，郭润民，吴 文△

(1南方医科大学，广东 广州 510515;2广东省医学科学院，广东省人民医院东病区内分泌科，广东 广州 510080;3中山大学医学院生理学教研室，广东 广州 510080)

雷奈酸锶(strontium ranelat，Sr)是一种新型的抗骨质疏松药物，具有抑制破骨细胞骨吸收和促进成骨细胞骨形成的双重作用[1]，锶盐代表了在骨质疏松症治疗史上一个新的发展方向。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种多潜能成体干细胞，具有向成骨细胞分化的能力。在BMSCs向成骨细胞分化中，受到多种信号通路调控，其中转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、Wnt、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和刺猬蛋白(Hedgehog)信号通路发挥了重要作用。TGF-β1也在骨形成和骨吸收中的平衡方面起重要的作用，可促进BMSCs向成骨分化，抑制其向破骨细胞分化，它在骨重建过程中的作用逐渐成为人们研究的热点[2-3]。Smads蛋白直接参与 TGF-β超家族成员的信号转导过程，它作为TGF-β下游的信号蛋白分子，将TGF-β信号从细胞外转导到细胞核内，是TGF-β信号转导通路的始动因子[4-5]。Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)又称为核心结合因子 α1亚基(core-binding factor，alpha 1 subunit，Cbfα1)，是一种多功能转录因子蛋白，在成骨细胞的分化和骨形成方面起重要的作用，TGF-β等多种因子可作为Runx2的上游调节因子调节Runx2 的活性[6-7]。

我们前期研究已经证实Sr可通过上调TGF-β1和Runx2表达，促进BMSCs向成骨细胞分化[8]。因此，本实验在此基础上进一步阐明Sr是否通过TGF-β1/Smad信号通路诱导BMSCs向成骨分化。

材料和方法

1 主要材料

Sr干混悬剂由法国Servier公司惠赠;4周龄SD大鼠购自中山大学实验动物中心;DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco;青霉素、β-甘油磷酸钠、地塞米松和抗坏血酸购自Sigma;碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;细胞茜素红(alizarin red s)钙染色试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司;兔抗大鼠Smad2、p-Smad2和Runx2单克隆抗体购自Cell Signaling;GAPDH购自上海康成生物有限公司;SB431542购自Bioworld;Smad2小干扰RNA(Smad2-siRNA)由广州市锐博生物科技有限公司合成;脂质体 2000(Lipofectamine 2000，Lipo2000)Opti-MEM 购自Invitrogen。

2 主要方法

2.1 大鼠BMSCs的获取 取4周龄SD大鼠颈推脱臼处死，75%乙醇浸泡5～10 min，无菌操作下取双侧股骨和胫骨，剪去干垢端，用无菌注射器吸取含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素G和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液，并移至15 mL离心管;1000 r/min离心5 min，制成单细胞悬液，以(1～3)×105cells/cm2接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱内进行培养;24 h后半量换液，以后每2～3 d换液1次;倒置显微镜下观察细胞，至细胞融合至80%时进行传代，此后每隔3～4 d传代1次。

2.2 BMSCs的成骨诱导 选取第3～5代BMSCs，将细胞种植于培养皿或培养板中，待细胞贴壁后加入成骨诱导液(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸的DMEM/F12培养基)培养。

2.3 ALP活性的检测 选取第3～5代BMSCs接种于24孔板，各实验组给予不同处理因素后，在第7 d采用酶标法检测ALP活性。检测时将细胞收集后以0.2%Triton X-100裂解液裂解，裂解后用PBS洗2遍，12000 r/min离心10 min，取上清液按试剂盒说明书进行操作，于酶标仪490 nm波长处测定结果。

2.4 茜素红钙化结节染色 选取第3代BMSCs，接种于24 mm×24 mm 6孔板中，6孔板底部预先置入消毒过的载玻片。各组给予相应处理因素后，于第21 d对样本进行固定、染色及澄清处理。以上各步骤严格按照细胞茜素红钙染色试剂盒说明书进行。倒置显微镜下观察钙结节染色并拍照，每组取4个样本，每样本随机取1个视野(×100)，比较各组间的差异。

2.5 Western blotting法检测 p-Smad2、Smad2 和Runx2蛋白的表达水平 选取第3代细胞，接种于60 mm培养皿中，收集细胞时，先用预冷的PBS洗2遍，加入细胞裂解液，4℃裂解20～30 min，在冰上用预冷的细胞刮刀将细胞刮下移至1.5 mL EP管中，12000 r/min离心10 min，取上清液移至新的EP管中。应用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白浓度测定。经SDS-PAGE垂直凝胶电泳分离后，9 V 30 min转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h后分别加入 p-Smad2抗体 (1∶1500)、Runx2抗体(1∶500)及 GAPDH(1∶5000)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 5 min洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶2500)孵育1 h，之后 TBST 5 min 洗3 次，最后用发光试剂ECL显色，曝光，曝光后用TBST洗膜2～3 h，加入 Smad2(1∶1000)抗体。用 Smartview 软件分析目标条带灰度值，与内参照GAPDH条带灰度值校正后进行半定量分析。

2.6 RNA干扰技术 设计3条Smad2特异性siRNA及1条阴性siRNA。操作时带手套，使用无RNA酶的枪头、EP管和试剂。瞬时离心后，用灭菌ddH2O将siRNA冻干粉配成20 μmol/L储存液，分装保存，避免反复冻融。转染前1 d，接种适当数量的细胞至培养板或皿中，用不含双抗培养基培养细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中过夜，使转染时细胞密度达60%～70%。转染时先制备 siRNA-Lipo2000混合液:先用不含血清培养基Opti-MEM分别稀释siRNA储存液、Lipo2000，轻轻混匀，室温5 min将2种混合液混匀，室温孵育20 min，将siRNA-Lipo2000混合液加入不含双抗的细胞培养基中，混匀。6 h后弃去混合液，更换新鲜不含双抗的培养基，培养2～3 d后进行加药处理。

3 统计学处理

数据以均数 ±标准差(mean±SD)表示，SPSS 13.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验，进一步两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Sr上调p-Smad2表达

图1A 显示用 0.1、1、3、5 和 10 mmol/L Sr分别处理BMSCs 1 h，均可明显上调p-Smad2表达。当Sr为1 mmol/L时，p-Smad2的表达达到峰值，Sr为3、5和10 mmol/L时逐渐减少，但仍高于对照组(P＜0.01)。图1B显示，应用1 mmol/L Sr分别处理BMSCs 15、30、60、120 和 360 min，Sr作用 60 min 时 p-Smad2的表达达到峰值，120 min和360 min时呈逐渐减小趋势，但仍高于对照组(P＜0.01)。

2 Sr上调Runx2表达

图2显示，应用1 mmol/L Sr分别处理BMSCs 1、3、5和7 d，Sr作用第5 d时，Runx2表达达到峰值，第7 d较第5 d表达有所减少，但仍高于对照组(P＜0.01)。

3 TGF-β1阻断剂拮抗Sr对p-Smad2表达的上调作用

图 3显示，1 mmol/L Sr处理 BMSCs 1 h，p-Smad2表达较对照组明显增加(P＜0.01);TGF-β1特异性阻断剂SB431542预处理BMSCs 1 h，可明显地阻断Sr对BMSCs p-Smad2表达的上调作用，与Sr处理组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

Figure1.Strontium ranelate(Sr)enhanced the expression of p-Smad2 in BMSCs.A:BMSCs were treated with different concentrations of Sr;B:BMSCs were treated with Sr at 1 mmol/L for different time.Mean±SD.n=3.##P ＜0.01 vs control(0 mmol/L or 0 min).图1 Sr对BMSCs p-Smad2表达的影响

4 Smad2 siRNA有效链的筛选

图4显示，与Sr组相比较，Smad2-siRNA的3条片段均能降低Smad2蛋白的表达(P＜0.01)，其中Smad2-siRNA003的作用最为明显(P＜0.01)。

5 Smad2-siRNA对Sr诱导p-Smad2表达上调的影响

图 5显示，1 mmol/L Sr处理 BMSCs 1 h，p-Smad2表达较对照组明显增加(P＜0.01)，Smad2 siRNA转染BMSCs后，再予以1 mmol/L Sr处理细胞，Sr诱导p-Smad2的表达增加较单纯Sr组明显减少(P ＜0.01)。

Figure2.Effect of Sr on the expression of Runx2 in BMSCs of rats.BMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for the different time.Mean ± SD.n=3.#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs 0 d.图2 Sr对BMSCs Runx2表达的影响

Figure3.Inhibitor of TGF-β1(SB431542)inhibited Sr-induced over-expression of p-Smad2 in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with Sr(1 mmol/L)for 1 h;Sr+SB431542:BMSCs were pretreated with 1 mmol/L SB431542 for 1 h，followed by treatment with Sr(1 mmol/L)for 1 h.Mean±SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.图3 TGF-β1阻断剂SB431542拮抗Sr对BMSCs p-Smad2表达的上调作用

Figure4.Screening of the effective Smad2-siRNA.BMSCs were transfected with Smad2-siRNAs，followed by treatment with Sr.Mean ±SD.n=3.##P ＜0.01 vs Sr.图4 Smad2-siRNA有效链的筛选

Figure5.Smad2-siRNA inhibited overexpression of p-Smad2 induced by Sr in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with Sr(1 mmol/L)for 1 h;Sr+Smad2-siRNA or Sr+non-target siRNA:BMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with Sr.Mean± SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜ 0.01 vs Sr.图5 Smad2-siRNA抑制Sr诱导的BMSCs p-Smad2表达

6 Smad2-siRNA对 Sr诱导 Runx2表达上调的影响

图6显示，1 mmol/L Sr处理 BMSCs 5 d，Runx2表达较对照组明显增加(P＜0.01)，Smad2-siRNA转染BMSCs后，再予1 mmol/L Sr处理细胞，Sr诱导的Runx2表达增多较Sr组明显减少(P＜0.01)，提示Smad2通路介导Sr对BMSCs Runx2表达的上调作用。

Figure6.Effect of Smad2-siRNA on the increased Runx2 expression induced by Sr in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with Sr(1 mmol/L)for 1 h;Sr+Smad-2siRNA or Sr+non-target siRNA:rBMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with Sr.Mean ± SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.图6 Smad2-siRNA抑制Sr诱导的BMSCs Runx2表达

7 Smad2 siRNA对Sr诱导的ALP活性增加的影响

图7显示，与对照组比较，1 mmol/L Sr处理BMSCs 7 d明显增加ALP活性(P＜0.05);Smad2-siRNA转染BMSCs后，使Sr对ALP活性的促进作用受到明显抑制，与 Sr处理组相比，差异显著(P＜0.05)。

8 Smad2 siRNA对Sr诱导钙结节数量增多的影响

图8显示，1 mmol/L Sr处理BMSCs 21 d可显著增加钙结节的数量;Smad2-siRNA转染BMSCs后，使Sr对钙结节形成的促进作用受到明显抑制。

Figure7.Effect of Smad2 siRNA on the increased activity of ALP induced by Sr in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 7 d;Sr+Smad2-siRNA or Sr+non-target siRNA:rBMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with 1 mmol/L Sr for 7 d.Mean±SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.图7 Smad2-siRNA对Sr诱导的BMSCs ALP活性增加的影响

Figure8.Effect of Smad-2siRNA on Sr-induced mineralization in BMSCs of rats(alizarin red S staining，×100).Sr:BMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 21 d;Sr+Smad2-siRNA or Sr+non-target siRNA:BMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with 1 mmol/L Sr for 21 d.图8 Smad2-siRNA对Sr诱导的BMSCs钙结节增多的影响

讨 论

BMSCs的定向成骨分化受到多种信号通路的调控[9]，已经明确的包括 TGF-β 通路、Notch 通路[10]、PI-3K 通路、Wnt通路、Hedgehog[11]通路和 MAPK 通路，其中包括 p38 MAPK 通路[12]、ERK 通路和 JNK通路[13]。TGF-β超家族包括多个亚家族，它们是一类结构相似、功能不同的肽类物质，包括TGF-βs、激活素(activins)、抑制素(inhibins)、骨形成蛋白(BMPs)及苗勒抑制物(mullerian)等。Smads信号蛋白是一种在TGF-β超家族成员细胞内信号转导中起重要作用的转录因子[14]，可分为8个亚型，其中Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8 属于调节型(R-Smads)，Smad4 属共同介导型(Co-Smads)，Smad6和Smad7属于抑制型(I-Smads)。在哺乳动物体内，Smad2、3 可被 TGF-β1型受体和 activins活化，又称为AR-Smads，它们通过磷酸化的方式开始细胞内的信号转导[15]。

本研究在原有的基础上[8]进一步证实，Sr在促进BMSCs向成骨细胞分化的过程中，明显地促进p-Smad2的表达和Runx2的表达。为了探讨Sr促进p-Smad2表达的分子机制，本文观察了TGF-β1特异性阻断剂SB431542对Sr促进p-Smad2表达的影响。研究结果表明，SB431542能明显抑制Sr对BMSCs p-Smad2表达的促进作用，进一步证实 TGF-β1位于Smad2的上游，这与前文的报道[4-5]相一致，为了进一步探讨Smad2通路在Sr促进BMSCs向成骨细胞分化过程中的作用，本文应用RNA干扰技术沉默了BMSCs的 Smad2。研究结果表明，Smad2-siRNA不仅明显地抑制了Sr对Runx2表达的上调作用，而且抑制了Sr对ALP活性及钙结节数量的促进作用，由于Runx2的表达是成骨细胞开始分化的标志，能诱导BMSCs发育成为成骨细胞。另一方面，ALP活性是成骨的早期指标，而钙结节形成是成骨的晚期指标，因此，本研究结果表明Smad2通路在Sr促进BMSCs向成骨细胞分化过程中起着重要的作用。

综上所述，本文证实了Sr可通过TGF-β1通路调节Smad2活动;激活TGF-β1-Smad2通路可能是Sr促进BMSCs向成骨细胞分化的重要机制之一。本文为深入阐明Sr的促成骨细胞机制提供了新颖的实验资料。

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