热带假丝酵母SG-1产单细胞蛋白的发酵培养基优化

江西农业大学生物科学与工程学院 李昆太 周 佳 庞会忠 叶亚健 程 新

单细胞蛋白（SCP）又称微生物蛋白或菌体蛋白，通常可通过细菌、酵母菌等微生物利用食品工业及轻工业的副产品或下脚料发酵培养而得 （郭状等，2008；许倩等，2007）。酵母菌是广泛用于生产SCP的菌种，主要包括假丝酵母属、丝孢酵母属、汉森酵母属和接合豆孢酵母属等（马旭光和张宗舟，2010）。SCP所含的营养物质极为丰富，具有丰富的粗蛋白质、氨基酸、维生素和促生长因子，是一类理想的蛋白质饲料（张建刚，2010）。因此，利用非食用资源和废弃资源开发和推广微生物生产单细胞蛋白饲料已成为补充饲料蛋白来源不足的重要途径（张秋华等，2009）。甜高粱秸秆汁是一类糖含量丰富的农副产品，本文以甜高粱秸秆汁为主要发酵原料，采用DPS软件（DPS v 7.05版）的二次正交旋转中心组合试验设计方法对热带假丝酵母SG-1产SCP的发酵培养基进行优化，以期为SCP的工业化发酵生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 甜高粱秸秆汁、工业葡萄糖、工业蛋白胨，其他无机盐试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器 摇床、低速大容量离心机、烘箱、培养箱等。

1.3 菌种 热带假丝酵母SG-1（Candida tropicalis SG-1）：由本实验室保存。

1.4 培养基

1.4.1 斜面培养基 工业葡萄糖 20 g/L，工业蛋白胨 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，NaC10.1 g/L，琼脂 20 g/L；pH 自然。

1.4.2 发酵培养基组分 甜高粱秸秆汁、工业葡萄糖、 工业蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4；pH 自然。

1.5 方法

1.5.1 斜面培养 从-20℃的冰箱中取出保藏好的甘油管菌种，接种于配制好的斜面，置于28℃恒温培养箱培养60 h。

1.5.2 摇瓶分批发酵 以无菌水洗下斜面上的菌体，制成菌悬液。取菌悬液1 mL接至装量为30 mL/250 mL三角瓶的发酵培养基中，30℃振荡（180 r/min）培养36 h。测定结果为三个平行样的平均值。

1.6 单细胞蛋白的测定方法 吸取30 mL发酵液，4000 r/min下离心10 min，离心所得菌体以蒸馏水清洗三次后在65℃下烘干至恒重。采用凯氏定氮法测定干菌体中粗蛋白质含量。根据公式：单细胞蛋白含量（g/L）=菌体干重（g/L）×粗蛋白质含量，计算出发酵液中的单细胞蛋白产量 （高玉荣等，2010）。

2 结果与讨论

以放瓶时（36 h）的SCP产量为考察指标，应用DPS软件（DPS v 7.05版）的二次正交旋转中心组合试验设计方法对热带假丝酵母SG-1的发酵培养基（甜高粱秸秆汁、工业葡萄糖、工业蛋白胨、MgSO4·7H2O 和 KH2PO4）进行优化。 试验因素和水平设计见表1，试验设计和结果见表2。

表1 二次正交旋转组合设计因素水平表及编码值

由表2可见，在所有试验配方中，1号配方（即：甜高粱秸秆汁180 mL/L；工业葡萄糖 30 g/L，工业蛋白胨 30 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO43 g/L）的SCP产量最高，达13.84 g/L。为了进一步探讨发酵培养基各组分之间的交互作用以及合适的组分控制浓度，对试验结果进行方差分析，结果见表3。

由表3可见，当显著水平为0.01时，X1、X2、X3这三项达均到极显著水平，即发酵培养基中甜高粱秸秆汁、葡萄糖及蛋白胨的用量对热带假丝酵母SG-1产SCP影响均极显著。对试验数据进行二次多项回归拟合，获得多元二次回归方程：

表2 热带假丝酵母SG-1二次正交旋转组合设计及试验结果

式中，Y 为 SCP 的预测值；X1、X2、X3和 X4分别为甜高粱秸秆汁、工业葡萄糖、工业蛋白胨、MgSO4·7H2O 和 KH2PO4的编码值。

由于该模型比较复杂，响应曲面函数既没有最大值，也没有最小值。为了更加直观地说明甜高粱秸秆汁、工业葡萄糖、工业蛋白胨、MgSO4·7H2O和KH2PO4对热带假丝酵母产SCP的影响以及表征响应曲面函数的性状，用DPS软件作出以两两自变量互作效应的三维曲面图 （图 1）。

图1a显示了甜高粱秸秆汁与葡萄糖的交互作用，发酵培养基中甜高粱秸秆汁与葡萄糖的浓度对热带假丝酵母SG-1产SCP的产量影响极显著，二者对SCP产量均表现出正效应；图1b显示了甜高粱秸秆汁与蛋白胨的交互作用，二者同样对SCP产量影响极显著且均表现出正效应；图1c显示了甜高粱秸秆汁与无机盐的交互作用，甜高粱秸秆汁对SCP产量的正作用最为显著，而无机盐浓度对SCP产量没有表现出较大影响；图1d显示了葡萄糖与蛋白胨的交互作用，二者在试验值范围内均对SCP产量表现出显著的正效应；图1e显示了葡萄糖与无机盐的交互作用，在试验值范围内，它们的交互效应不显著，但葡萄糖对SCP产量表现出一定的正效应；图1f显示了蛋白胨与无机盐的交互作用，在试验值范围内，它们的交互效应也不显著，而蛋白胨对SCP产量表现出一定的正效应。

表3 试验数据方差分析结果

以上结果可以说明，发酵培养基中的甜高粱秸秆汁、葡萄糖与蛋白胨用量对热带假丝酵母SG-1产SCP的影响均极显著，在试验值范围内随着其浓度的提高，SCP产量均表现出极显著的上升趋势。因此，用DPS软件优化的热带假丝酵母SG-1发酵培养基为所考察的4个因素均应取最高水平值（+1.6818），即甜高粱秸秆汁 220 mL/L、葡萄糖 37.5 g/L、 蛋白胨 37.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.75 g/L、KH2PO43.75 g/L。以该优化的发酵培养基配方进行热带假丝酵母SG-1摇瓶分批发酵的验证试验，最终的菌体湿重达到129.04 g/L，干重为34.20 g/L，SCP产量为15.38 g/L，比原始配方下SCP产量（10.77 g/L）提高了42.80%。

3 结论

在以二次正交旋转组合设计方法 （DPS软件v7.05版）进行热带假丝酵母SG-1产SCP的发酵培养基优化过程中发现，培养基中甜高粱秸秆汁、葡萄糖与蛋白胨的用量对热带假丝酵母SG-1产SCP表现出极显著的正效应。因此，热带假丝酵母SG-1产SCP的较佳发酵培养基组成为：甜高粱秸秆汁220 mL/L、葡萄糖37.5 g/L、蛋白胨37.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.75 g/L、KH2PO43.75g/L。该发酵培养基配方下SCP产量达到15.38 g/L，比初始发酵培养基配方下的SCP产量（10.77 g/L）提高了42.80%。

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