离心运动对大鼠骨骼肌线粒体ATP酶活性及desmin表达影响的研究

白 巍，张海平

离心运动对大鼠骨骼肌线粒体ATP酶活性及desmin表达影响的研究

白 巍，张海平

（沈阳体育学院运动人体科学学院，辽宁沈阳110102）

目的：从细胞内线粒体Ca2＋转运系统入手，探讨离心运动对大鼠骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性及desmin表达影响，以期进一步揭示骨骼肌运动性损伤的发生机制。方法：雄性SD大鼠96只，体重304g±12g，随机分为安静对照组、运动后即刻组、运动后12h组、运动后24h组、运动后48h组、运动后72h组、运动后5d组、运动后7d组。采用一次性下坡跑训练建立运动损伤模型，取大鼠肱三头肌，部分肌肉做desmin免疫组化切片，并进行定量分析；余下肌肉差速离心提取线粒体，测定线粒体各ATP酶活性。结果：1）离心运动后大鼠骨骼肌desmin表达从运动后即刻到24h呈逐渐下降的趋势，以运动后24h下降最为明显，48h开始回升，第5d达到最高，第7d略有下降，但仍明显高于安静对照组。2）离心运动后即刻大鼠骨骼肌细胞线粒体Ca2＋－ATPase、Ca2＋－Mg2＋－ATPase和Na＋－K＋－ATPase的活性显著下降，12h、24h酶活性有所恢复，仍然明显低于安静对照组；48h后各ATP酶结果与安静对照组均无显著差异。结论：大鼠离心运动后骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性变化与desmin表达之间存在着某种密切相关的联系，线粒体钙调节失衡是导致骨骼肌运动损伤的一个重要原因；而离心运动后desmin表达的变化，对骨骼肌运动性损伤形态学变化的早期界定和损伤恢复程度的判断具有重要的参考价值。

离心运动；大鼠骨骼肌；线粒体；ATP酶活性；desmin表达

目前，骨骼肌运动损伤的机制有许多学说，包括代谢学说和机械损伤学说等，但无论哪种学说，都与骨骼肌细胞内胞浆Ca2＋浓度的变化有关［1］。在细胞内 Ca2＋的调节中，线粒体Ca2＋转移系统对胞内Ca2＋起着持久的、大容量的调节，而线粒体Ca2＋含量和ATP酶活性的变化与骨骼肌损伤也有着密切的内在联系。近年来，学者在探讨骨骼肌运动损伤机制的基础上，对肌肉损伤时细胞骨架蛋白的结构变化等进行了许多研究［2－3］，越来越多的肌肉病理专家认为，了解并掌握骨架蛋白在损伤肌肉中的表达是深刻理解肌肉损伤病理机制的一个重要环节。临床上，常采用细胞骨架蛋白来判断肿瘤组织来源，或是作为不同种肌病的病理分型依据，而系统的有关离心运动后骨架蛋白表达与线粒体ATP酶活性的相关研究尚不多见，故本研究对揭示骨骼肌运动损伤肌细胞desmin的表达规律及发生机制等具有非常重要的意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料与分组

雄性SD大鼠96只，体重302g±12g，购于沈阳医学院实验动物中心。大鼠购回后，随机分为安静对照组（con）、运动后即刻组（oh）、运动后12小时组（12h）、运动后24小时组（24h）、运动后48小时组（48h）、运动后 72小时组（72h）、运动后5天组（5d）、运动后7天组（7d）。组间动物体重无显著性差异，实验前所有动物均未进行过跑台运动。实验室温度（22±3）℃，相对湿度50% ～60%，光照时间：7：00－19：00。

1.2 运动损伤模型

运动损伤模型在在沈阳体育学院国家体育总局重点实验室内进行，采用一次性下坡跑运动训练建立运动损伤模型［4］。实验前2天，所有动物进行5～10min跑台运动，速度为5～10m／min，坡度为0°。实验时，所有运动组动物均进行持续性下坡跑，速度为16m／min，坡度为－16°，总运动时间为200min，100min运动结束后，动物休息5min，然后再进行100min运动。

1.3 骨骼肌desmin免疫组化切片制作

骨骼肌desmin免疫组化切片在中国医科大学免疫组化实验室完成。大鼠运动结束后，各组按不同时间点，腹腔注射戊巴比妥溶液，剂量为0.25～0.5g／kg体重，取右侧肱三头肌，制作骨骼肌desmin免疫组化切片，试剂盒采用武汉博士德生物工程有限公司产品。每组切片取6张，按对角线划分区域任选取5个视野，显微镜下观察（×400倍），用 motic image 3.0分析软件进行分析。参数设定：目标总面积占图像视场的百分比：目标总面积占图像视场的百分比（%）＝（目标总面积÷视野区域面积）×100%，代表desmin表达。

1.4 骨骼肌细胞线粒体制备［1，5］

称取1.5克肌组织，在冰浴上剪成碎块，按重量体积1∶4.5的比例加入事先预冷的0.25M蔗糖－0.01MTris缓冲液，制备成组织匀浆。匀浆液在高速冷冻离心机内经差速离心提取线粒体，并置于0.5ml的0.25M蔗糖－0.01MTris缓冲液中待测。以上步骤均在0～4℃环境中进行。

1.5 大鼠肱三头肌线粒体ATP酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所提供的超微量ATP酶测试盒和6010紫外－可见分光光度计（安捷伦上海分析仪器厂）。样品取量及吸光度测定均严格按照试剂盒说明书所示程序进行操作。计算公式：组织中ATPase活力（U／mgprot）＝（测定管OD值-对照管OD值）／（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（0.02μmol／ml）×6* ×A** ÷蛋白含量（mgprot／ml）。其中公式中：6*：定义上为每小时，实际操作为l0分钟反应；A**：代表反应体系中稀释的倍数，其中Ca2＋－ATPase为2.8倍，Ca2＋－Mg2＋－ATPase、Na＋－K＋－ATPase为7.8倍。

1.6 数理统计法

采用SPSS 13.0统计软件对数据均进行处理，单因素方差分析（ANOVA）进行组间差异显著性检验，显著性水平为P＜0.05。

2 研究结果

2.1 离心运动后大鼠骨骼肌细胞desmin表达影响

表1可以看出，与安静对照组相比，离心运动后大鼠骨骼肌desmin表达从运动后即刻到24h呈逐渐下降的趋势，以运动后24h下降最为明显（P＜0.05）；48h开始回升，到第5d达到最高，为安静对照组的114.70%（P＜0.05）；第7d略有下降，但仍明显高于安静对照组，为安静对照组的112.09%（P＜0.05）。

表1 离心运动后不同时刻大鼠骨骼肌desmin表达影响

2.2 离心运动后大鼠骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性变化

表2可以看出，大鼠骨骼肌细胞线粒体Ca2＋－ATPase、Ca2＋－Mg2＋－ATPase和 Na＋－K＋－ATPase的活性在离心运动后即刻即显著下降（P＜0.01），分别下降了52.31%、36.51%和47.19%；12h、24h酶活性有所恢复，仍然明显低于安静对照组（P＜0.01）；48h后各 ATP酶结果（Ca2＋－Mg2＋－ATPase 48h P＜0.05）与安静对照组均无显著差异（P＞0.05），表明ATP酶活性基本恢复正常。

表2 大鼠离心运动后不同时刻骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性变化

3 讨论

在骨骼肌细胞中，desmin为中等径细胞骨架纤维，对细胞结构的支撑、细胞形状的决定及细胞机械强度的赋予等有重要作用。高张力的机械牵拉会使细胞骨架的正常结构受到影响，进而造成肌肉收缩蛋白的结构破坏［6－8］，而 desmin的丢失被认为是骨骼肌运动性微损伤的一个较为敏感的形态学指标［9－10］。Friden等学者［10］曾对 6名男选手剧烈运动后的股外侧肌进行了活检，证明了在剧烈运动后有大量的desmin表达。Barash等［11］的研究发现，大鼠离心收缩后骨骼肌desmin染色下降在离心运动后12h为最明显。Lieber等研究也证实细胞骨架蛋白的水解是骨骼肌离心收缩损伤的重要原因［12－14］。袁建琴等［15］的研究显示，骨骼肌 desmin蛋白表达在运动后即刻出现显著性下降，且与超微结构中Z线等变化相似，也表现出延迟性变化的趋势。

一般认为，离心运动过程中，骨骼肌desmin的早期丢失是肌节破坏的证据，运动后第2天desmin出现升高，意味着肌原纤维开始重建［16－17］。研究表明，desmin在损伤和再生肌肉中的表达存在着一定的规律［18］。在正常肌纤维中，desmin在肌纤维和静息卫星细胞中有分布；肌肉损伤开始后，desmin表达下降；2天后，desmin表达增加；4天后，达到峰值并持续到3周之后。从本研究的结果看，骨骼肌损伤后desmin的表达从运动后即刻到24h呈逐渐下降的趋势，并以运动后24h下降最为明显；48h表达开始增加，到第5天达到最高，随后略有下降，但到第7天仍明显高于安静对照组。结果表明：离心运动后即刻骨骼肌即由于机械的高张力的作用而出现肌纤维损伤，表现出desmin的丢失，也反映了肌节的破坏，这种破坏以离心运动后24h最为明显，48h后desmin表达开始增加，但24h与48h之间没有明显差异，表明desmin的丢失与同期电镜的超微结构改变是基本一致的，后者表现的肌肉损伤的最严重程度与前者相比略有延迟。desmin的表达在48h开始增加，第5天达到最高，第7天略降但仍明显高于安静对照组，表明可能有新的肌节逐渐生成，也反映骨骼肌损伤后48h已体现出明显的修复过程，这与组织损伤的病理变化过程基本相符。

研究发现，骨骼肌细胞胞浆内Ca2＋增多的程度与肌细胞损伤的程度成正比［4，19］。田野采用非力竭间歇运动和力竭性持续运动，连续观察运动后线粒体钙含量的变化，发现两种负荷运动后线粒体钙含量的变化趋势基本一致，表明运动后线粒体聚钙可能与疲劳的发展密切相关［4］。周锦林等采用不同强度的跑台运动，发现股四头肌和腓肠肌线粒体Ca2＋－ATPase活性在大强度运动后略有变化，中等强度运动后显著下降，表明骨骼肌线粒体Ca2＋－ATPase活性下降可能是造成中等强度长时间运动后骨骼肌疲劳的原因之一［19］。本研究结果，大鼠离心运动后骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性的下降主要出现在运动后即刻到48h，并以运动后即刻下降最为明显，48h后各ATP酶活性基本恢复正常。ATP酶活性的降低，说明离心性负荷所致损伤过程中线粒体钙超载引起ATP生成减少，提示在骨骼肌损伤中线粒体钙超载也是细胞Ca2＋代谢紊乱和细胞损伤的直接原因。而骨骼肌损伤后desmin表达从运动后即刻到24h呈逐渐下降的趋势，并以运动后24h下降最为明显，显示大鼠离心运动后骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性与desmin表达之间存在着某种密切相关的联系，说明在骨骼肌损伤过程中Ca2＋大量内流，造成线粒体钙超载，过多的钙抑制线粒体的氧化代谢酶，使线粒体的ATP产生降低，进一步使细胞ATP依赖性离子泵功能下降，细胞内离子调控功能进一步下降，形成恶性循环；而过多的钙还可促进组织的自由基产生，促进脂质过氧化，使线粒体及离子泵损伤，进而导致或加重骨骼肌损伤。

4 结论

大鼠离心运动后骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性变化与desmin表达之间存在着某种密切相关的联系，线粒体钙调节失衡是导致骨骼肌运动损伤的一个重要原因；而离心运动后desmin表达的变化，对骨骼肌运动性损伤形态学变化的早期界定和损伤恢复程度的判断具有重要的参考价值。

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Eccentric Exercise upon Mitochondria ATP Enzymes Activity and Desmin Expression of Skeletal Muscles of Rats

BAI Wei，ZHANG Haiping
（School of Human Sports Science，Shenyang Sport University，Shenyang 110102，Liaoning，China）

Aim：The article studied the influence of eccentric exercise upon mitochondria ATPenzymes activity and desmin expression of skeletal muscles of rats from the angle of Ca2＋transporting system in miotochondria of cell，further discovering the mechanism of exercise-induced muscled damage（EIMD）.Methods：96 SD male rats（weight 304g±12g）were selected as the objects of this study and were randomly divided into groups of peaceful contrast（con）at 0h，12h，24h，48h，72h，5d，7d after exercise according to the time when the rats were killed.The model of injury was a bout of exhaustive eccentric exercise on a treadmill.Triceps brachiies were drawn for the immunohistochemical specimens of desmin and extracting of miotochondria.The immunohistochemical specimens of desmin were analyzed quantitatively under microscope.Miotochondria were extracted by the method of centrifugation at different speed and their activity were measured.Results：1）The expression of desmin of rats’skeletal muscles had a gradual descending tendency from the instant to 24 hour after eccentric exercise，and the descent at 24 hour was the most evident.From 48h，the expression began to increase and reached the top at 5d，then slightly decreased at 7d and its value was higher obviously than that of con.2）The activities of Ca2＋-ATPase，Ca2＋-Mg2＋-ATPase and Na＋-K＋-ATPase in miotochondria decreased obviously from the instant after eccentric exercise，the activities of ATPases of 12h and 24h increased slightly but were still lower obviously than that of con.The activities of ATPases of 48h and later time were not different obviously with that of con.Conclusions：The changes of mitochondria ATPenzyme’s activity were related closely to desmin’s expression of skeletal muscles of rats after eccentric exercise.The unbalance of Ca2＋regulation in mitochondria was an important reason of EIMD.The changes of desmin’s expression after eccentric exercise had a important reference value for the earlier injury diagnosis and the recovery’s judgment of EIMD.

eccentric exercise；skeletal muscles of rats；mitochondria；the activities of ATPases；desmin expression

G804.7

A

1004－0560（2013）02－0086－03

2012-09-07；

2012-11-26

辽宁省教育厅高校科学研究项目（20060850）。

白 巍（1956－），男，副教授，主要研究方向为运动解剖学。

张海平（1964－），男，教授，博士，主要研究方向为运动对骨骼肌形态和机能的影响。E－mail：Zhping2000＠126.com。

责任编辑：乔艳春