阿魏酸川芎嗪对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响*

赵润英, 郝 伟, 孟祥军, 赵丽妮, 李 昭, 马明洋, 丁双双, 魏 巍

(1沈阳医学院药理教研室，机能实验中心，药物研究中心,辽宁 沈阳 110034；2中国医科大学2011级11班，辽宁 沈阳 110001； 3沈阳博瑞生物技术有限公司，辽宁 沈阳 110014)

阿魏酸川芎嗪对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响*

赵润英1△, 郝 伟1, 孟祥军1, 赵丽妮1, 李 昭1, 马明洋2, 丁双双3, 魏 巍3

(1沈阳医学院药理教研室，机能实验中心，药物研究中心,辽宁 沈阳 110034；2中国医科大学2011级11班，辽宁 沈阳 110001；3沈阳博瑞生物技术有限公司，辽宁 沈阳 110014)

目的观察阿魏酸川芎嗪对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分成5组：(1)假手术组；(2)缺血再灌注组；(3)川芎嗪(4 mg/kg)组；(4)阿魏酸川芎嗪低剂量(4 mg/kg)组；(5)阿魏酸川芎嗪高剂量(8 mg/kg)组。采用结扎左冠状动脉前降支30 min、再灌注120 min的方法复制大鼠心肌缺血再灌注模型；各组大鼠于再灌注前10 min分别颈静脉注射给药，于再灌注结束后,进行血清生化及心肌组织学检测。结果阿魏酸川芎嗪能显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中肌酸激酶同功酶、乳酸脱氢酶、心肌钙蛋白I和丙二醛的水平，提高总超氧化物歧化酶活性，增加心肌Bcl-2蛋白的表达，减少心肌Bax蛋白的表达, 提高Bcl-2/Bax 的比值和降低心肌细胞凋亡指数，与缺血再灌注组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。阿魏酸川芎嗪各项指标优于川芎嗪(P<0.05或P<0.01)。结论阿魏酸川芎嗪能减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤；其抗缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡的机制可能与其上调Bcl-2蛋白和下调Bax蛋白表达有关。

阿魏酸川芎嗪； 心肌缺血； 再灌注损伤； 细胞凋亡； Bcl-2蛋白； Bax蛋白

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是冠状动脉再通术(溶栓、PTCA或搭桥术)后一个重要的并发症，也是致死原因之一。目前研究发现，选择在再灌注前或再灌注期间进行药物干预这一药理性后适应(pharmacological postconditioning)的方法，能够对心脏产生一定的保护作用[1]。阿魏酸川芎嗪(ligustrazine ferulate，LF)是对活血化瘀中药川芎的有效成分川芎嗪(ligustrazine，LZ)和阿魏酸(ferulic acid，FA) 进行结构修饰所得到的新化合物，具有明显的抗血栓形成和抗MIRI作用[2-3]。本研究拟观察LF药理性后适应对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响，旨在探讨其减轻MIRI的作用机制与凋亡调控基因的关系。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 健康雄性SD大鼠60只，体重250～300 g，沈阳医学院实验动物中心提供。

1.2仪器 DXI-800全自动化学发光免疫分析系统(Beckman Coulter)；7180全自动生化分析仪(Hitachi)；MiVnt图像分析系统(上海光学仪器研究所)；BL-420F生物机能实验系统和HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)。

1.3药品与试剂 盐酸川芎嗪注射液(安徽省立药业有限公司，20 mg/L);阿魏酸川芎嗪注射液(沈阳医学院药物化学教研室，20 mg/L)。肌酸激酶MB型(creatine kinase MB form,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、心肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche)。Bcl-2和Bax检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

2方法

2.1动物分组及给药 大鼠60只，随机分成假手术(sham-operation,SO)组、缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)组、LZ组、LF低剂量(4 mg/kg,LF1)组和LF高剂量(8 mg/kg，LF2)组，每组12只。各组于再灌注前10 min颈静脉注射给药，I/R组给同容量生理盐水。

2.2心肌I/R模型的建立 大鼠20%乌拉坦50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定。四肢皮下插入针形电极，连接BL-420F生物机能实验系统，记录Ⅱ导联心电图。右颈静脉置管用于输液给药。气管插管，接呼吸机。距胸骨左缘0.5 cm处，从第3至第5肋切皮行1 cm切口，分离肌层，剪断第3、4肋骨，打开胸腔，用自制小拉钩牵拉胸壁，撕开心包膜，充分暴露心底部，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到结扎标志血管左冠状静脉。3/8弧4×12圆针穿4/0缝线(预先将一个由带凹槽的细聚乙烯管制成的小环穿在缝线上)，在左心耳根部下方2 mm处, 以深1.5～2 mm，宽2～3mm穿过心肌表层，结扎左冠状动脉前降支，以心电图显示ST段抬高、QRS波高大增宽为结扎成功标志。阻断左冠状动脉30 min，在凹槽部剪断缝线，再灌注120 min，造成心肌MIRI模型(SO组只穿线不结扎)。

2.3心肌损伤标志物和氧化应激相关指标的检测 再灌注结束后，右颈动脉采血4 mL。血清采用比色法测定CK-MB和LDH,化学发光免疫分析法检测cTnI的水平；用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，羟胺法检测T-SOD活性。

2.4心肌细胞凋亡指标的检测 再灌注结束后取心脏，于4 ℃ PBS 中清洗2次，一次性纱布吸去水分，于冰浴中自结扎位点以下将心肌标本切为 5片。取第 3片(A、B 两面，A 面为上，B面为下)放于液氮速冻后存于-70 ℃。制作冰冻切片：B面朝上，组织包埋剂 OCT包埋，冰冻切片机连续切片，每个标本连续切片2张，厚度3μm，甲醇固定后存于-70 ℃。取第4片(A、B 两面，A面为上，B面为下) 放于10%中性甲醛(PBS 新鲜配制) 中24 h后转移至70%乙醇保存。制作石蜡切片：流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋(A 面朝上，60 ℃)，每个标本连续切片3张，厚度2 μm，60 ℃烤箱烤片10 h后常温保存。

2.4.1TUNEL法检测心肌凋亡细胞 应用改进的TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡[4]。共聚焦显微镜下，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈蓝绿色。计算细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)。AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2.4.2免疫组化法检测心肌组织Bcl-2和Bax蛋白的表达 应用链霉素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)免疫组化法，以Bcl-2和Bax抗体为Ⅰ抗进行免疫组化染色，加DAB显色(严格按试剂盒说明书操作)。在400倍光镜下，阳性细胞胞浆呈片状棕色和胞浆内棕色颗粒。计数Bcl-2和Bax阳性细胞数，计算阳性细胞表达指数(positive expression index,PEI)，PEI(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%，再求Bcl-2/Bax蛋白表达阳性细胞比值。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，3个及以上组间均数比较采用方差分析，有统计学意义时，再用Dunnett法进行两两比较。采用SPSS 13.0软件处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1心肌损伤标志物和氧化应激相关指标的检测结果

与SO组比较，I/R组血清CK-MB、LDH、cTnI和MDA水平提高，T-SOD活性降低(P<0.01)。与I/R组比较，LF各组能显著降低血清中CK-MB、LDH、cTnI等心肌损伤标志物的水平，减少MDA含量和提高T-SOD的活性(P<0.01)，见表1。

表1 心肌损伤标志物和氧化应激相关指标的检测结果

▲▲P<0.01vsSO group;**P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsLZ+I/R group;★P<0.05vsLF1+I/R group.

2心肌细胞凋亡的检测结果

2.1TUNEL法检测凋亡细胞 SO组心肌细胞凋亡极少，I/R组心肌细胞凋亡数量明显增多，AI明显提高，两者比较差异显著(P<0.01)；LZ组和LF各组心肌细胞凋亡数量明显减少，AI明显降低，与I/R组比较，差异显著(P<0.05或P<0.01)，见图1和表2。说明LZ和LF对心肌细胞凋亡均有明显的抑制作用。

2.2免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达 SO组仅有极少数散在的Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞；与SO组比较，I/R组Bax蛋白阳性细胞数明显增多(P<0.01)的同时，Bcl-2蛋白阳性细胞也略有增加，但Bcl-2/Bax比值显著下降(P<0.05)，与I/R组比较，LF各组的 Bcl-2蛋白阳性细胞明显增多，Bax蛋白阳性细胞数明显减少，Bcl-2/Bax的比值提高显著(P<0.01)，见图2、3和表2。这说明LF抑制细胞凋亡的机制与其上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达和下调凋亡促进蛋白Bax的表达有关。而LZ对Bax蛋白表达无明显影响。

Figure 1. Effects of ligustrazine ferulate on myocardial apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

图1阿魏酸川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响

表2 心肌细胞凋亡指标的检测结果

▲▲P<0.01vsSO group;*P<0.05，**P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsLZ+I/R group;★P<0.05,★★P<0.01vsLF1+I/R group.

Figure 2. Effects of ligustrazine ferulate on the expression of Bcl-2 in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

图2阿魏酸川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2表达的影响

Figure 3. Effects of ligustrazine ferulate on the expression of Bax in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

图3阿魏酸川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤大鼠Bax表达的影响

表1、表2显示，LF各组的部分血清生化和心肌组织学指标优于LZ组(P<0.05)，说明LF对心肌缺血再灌注损伤的保护作用和抗细胞凋亡作用强于LZ。

讨 论

MIRI病理生理机制复杂，其中中性粒细胞激活以及氧自由基(oxygen free radical,OFR)的增多均发挥重要作用[5]。缺血再灌注后大量中性粒细胞黏附于缺血区血管内皮细胞，破坏内皮细胞的屏障功能，使血管的通透性增加，当其进入缺血病灶后，进一步释放炎症介质，从而加重心肌损伤[6-8]。OFR在与脂质发生过氧化反应，形成MDA等脂质过氧化物，引起心肌细胞氧化应激损伤的同时，还会诱导心肌细胞大量凋亡[9]。细胞凋亡是再灌注损伤发病机制中的一个重要环节，它的发生受多种基因调控，bcl-2是凋亡抑制基因，bax是凋亡促进基因，而Bcl-2/Bax比值是反映心肌生存能力的重要指标[10-11]。前期研究表明，LF能够抑制血小板活化，降低大鼠血小板P-选择素的表达，从而抑制血小板中性粒细胞的黏附，产生抗血栓形成作用，对急性心肌缺血具有一定的预防效果。本文利用大鼠心肌缺血再灌注模型研究发现，LF能够明显提高血清T-SOD的活性、减少MDA的含量，降低血清中CK-MB、LDH、cTnI等心肌损伤特异指标的水平，能够增加Bcl-2蛋白、减少Bax蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值和降低心肌细胞凋亡指数，体现了LF对缺血再灌注损伤心肌的良好保护作用。其机制可能是通过提高抗氧化酶的活性，清除OFR，在抑制脂质过氧化反应，减少心肌细胞氧化应激损伤的同时，通过上调凋亡抑制基因bcl-2和下调凋亡促进基因bax的表达，提高Bcl-2/Bax比值，来抑制心肌细胞凋亡，从而减轻MIRI。LZ和FA在临床上广泛应用于缺血性心脑血管疾病的治疗，并取得了较好的疗效，本课题组对FA和LZ的结构进行修饰合成的LF，减轻MIRI的作用强于川芎嗪。因此，可以预见其有较好的应用前景。

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Effectsofligustrazineferulateonmyocardialapoptosisandapoptosis-relatedproteinexpressioninratswithmyocardialischemia-reperfusioninjury

ZHAO Run-ying1, HAO Wei1, MENG Xiang-jun1, ZHAO Li-ni1, LI Zhao1, MA Ming-yang2, DING Shuang-shuang3, WEI Wei3

(1DepartmentofPharmacology,CenterforFunctionalExperiment,CenterforDrugResearch,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China;2Class11,Grade2011,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;3ShenyangBoreyBiotechnologyLimitedCompany,Shenyang110014,China.E-mail:zry933@126.com)

AIM: To observe the effects of ligustrazine ferulate on the apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury, and to explore its possible mechanism.METHODSSixty male SD rats were randomly divided into five groups: sham-operation group, ischemia-reperfusion group, ligustrazine (4 mg/kg) group, low-dose (4 mg/kg) ligustrazine ferulate group and high-dose (8 mg/kg) ligustrazine ferulate group. The rat myocardial ischemia-reperfusion model was established by 30 min of myocardial ischemia followed by 120 min of reperfusion. Drugs were administered to the rats by jugular vein injection 10 min before reperfusion. After the reperfusion was finished, the biochemical indicators in serum and the histological indexes in myocardium were detected.RESULTSCompared with ischemia-reperfusion group, ligustrazine ferulate lowered the serum levels of creatine kinase MB form, lactate dehydrogenase, cardiac troponin I and malondialdehyde, elevated the activity of total superoxide dismutase in serum and the expression of Bcl-2 protein in myocardium, decreased the expression of Bax protein and myocardial apoptotic index, and increased the Bcl-2/Bax ratio (allP<0.01). All the indicators in ligustrazine ferulate groups were dose-dependently superior to those in ligustrazine group (P<0.05 orP<0.01).CONCLUSIONLigustrazine ferulate protects rats against myocardial ischemia-reperfusion injury. Its anti-apoptotic effect may be related to up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Bax.

Ligustrazine ferulate; Myocardial ischemia; Reperfusion injury; Apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.005

1000- 4718(2013)12- 2139- 05

2013- 05- 14

2013- 10- 15

沈阳市科技计划项目(No.F10-149-9-16)

△通讯作者 Tel: 024-62215687; E-mail: zry933@126.com