红细胞生成素对慢性肾衰竭大鼠外周血内皮祖细胞SDF-1及其受体表达的影响*

万建新， 崔 炯， 高 娜， 杨 霞， 李镇洲， 陈 俊， 邹臻寰， 尤丹瑜

(福建医科大学附属第一医院肾内科，福建福州350005)

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是成熟血管内皮细胞的前体细胞。我们前期的研究表明红细胞生成素(erythropoietin，EPO)能促进5/6肾大部切除大鼠外周血EPCs的动员和增殖，改善外周血EPCs黏附能力和形成血管腔样结构的能力，促进肾小球毛细血管内皮功能的修复、减轻肾脏的病理改变和改善肾功能［1-2］。但外周血EPCs如何被动员的确切机制尚不清楚。有研究表明EPO可显著提高健康人群和肾衰竭患者EPCs的数量与功能，并可能与提高EPCs中Akt蛋白激酶的活性有关［3］。最近我们的研究表明EPO可激活5/6肾大部切除大鼠残肾组织归巢因子及其受体的表达，这可能也是EPCs参与损伤肾脏修复的重要机制之一［4］。本文观察EPO干预慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)大鼠后，外周血EPCs归巢因子——基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及其受体CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)的表达是否受到影响。

材料和方法

1 材料

1．1 动物 成年雄性6周龄SD大鼠(体重200～250 g)，购自吴氏动物中心(编号为2007000521321)。

1．2 主要试剂 M199培养基和胎牛血清(Gibco)，血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor，VEGF;PeproTech)，重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠海亿胜生物制药)，人纤维连接蛋白(Chemicon)，FITC标记的荆豆凝集素1(Ulex europaeus agglutinin 1，UEA1;Sigma)，DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(acetylated DiI-labeled low density lipoproteins，acLDL-DiI;Molecular Probe)，人重组EPO(益比奥，三生制药)，PE标记的血管内皮生长因子受体2(vascular epithelial growth factor receptor 2，VEGFR2;R＆D)，PE标记的CD133单克隆抗体(BD)，PE标记的CD34单克隆抗体(Miltenyi Biotec)，FITC标记的抗大鼠Ⅱ抗(北京中山)，Trizol(Invitrogen)，PCR试剂盒(TaKaRa)，EPO抗体(Santa Cruz)，红细胞生成素受体(erythropoietin receptor，EPOR)抗体(Santa Cruz)，SDF-1α抗体和CXCR4抗体(Abcam)。

2 方法

2．1 动物模型制备及分组 采用分阶段5/6肾切除制备大鼠慢性肾衰竭模型:10%水合氯醛腹腔麻醉后，经侧腹部切口，暴露左侧肾脏，分离肾动脉及其分支，结扎其中的左上支和中支并剪断，使左肾梗死约2/3，3 d后再将大鼠右肾摘除。21只SD大鼠随机分为3组(每组7只):假手术组、CRF模型组和EPO治疗组。假手术组仅分离肾动脉及其分支，不予结扎;EPO治疗组于第2次手术后3周开始皮下注射30 U/kg EPO，每周3次，连用6周。所有大鼠均于造模后8周处死。

2．2 外周血EPCs分离、培养与鉴定 SD大鼠处死后心脏采血5 mL，采用Ficoll密度梯度离心法分离出单核细胞，并进行细胞培养。EPCs鉴定采用DiIAcLDL和FITC-UEA1双荧光染色法。EPCs培养和鉴定的方法参见本课题组前期工作［1］。

2．3 实时荧光定量PCR 各组大鼠外周血EPCs总RNA的提取和cDNA的合成按试剂盒的说明书进行。所用的引物序列及扩增长度见表1(由TaKaRa公司协助设计并合成)。定量扩增用 ABI PRISM 7500 Fast荧光PCR仪，采用SYBR Green PCR方法进行。PCR反应条件为:95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环。反应结束后确认PCR扩增曲线和融解曲线。以GAPDH为内参照，采用比较Ct法相对定量，结果以两组间目的基因拷贝数比值(relative quantification，RQ)表示。每个cDNA模板标本重复检测3次，结果取平均值，每次反应3个基因各设阴性空白对照1个。

2．4 Western blotting检测 各组大鼠外周血EPCs用裂解缓冲液处理，按Bradford蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白含量。并按经典方法配制10%SDSPAGE分离胶和5%浓缩胶进行蛋白电泳。将电泳的凝胶以相同大小的NC膜进行转膜。将封闭好的NC膜分别放入用封闭液稀释的Ⅰ抗中孵育，用增强化学发光使胶片显影，扫描后用 White/Ultraviolet Transilluminator系统软件分析，蛋白表达量用积分吸光度(integrated absorbance，IA)值来表示。以β-actin为内参照，进行半定量分析，比值表示其相对含量。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，经方差齐性检验和组内的方差分析。用 SPSS 15．0统计软件包分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

表1 引物序列Table 1．Sequences of the primers

结 果

1 EPO对外周血EPCs归巢因子及其受体表达影响

实时荧光定量PCR结果显示，与CRF组比较，治疗组外周血EPCs SDF-1和CXCR4 mRNA表达显著增高(均P ＜0．05)，见图1。Western blotting结果显示，与模型组比较，治疗组外周血EPCs SDF-1和CXCR4蛋白表达显著增高(均P＜0．05)，见图2。

2 EPO对外周血EPCs EPO及EPOR的影响

实时荧光定量PCR结果显示，与CRF组比较，治疗组外周血EPCs EPO及EPOR mRNA表达显著增高(均 P ＜0．05)，见图 3。Western blotting结果显示，与模型组比较，治疗组外周血 EPCs EPO及EPOR蛋白表达显著增高(均P＜0．05)，见图4。

Figure 1．Effects of EPOon mRNA expression of SDF-1 and CXCR4 in peripheral blood endothelial progenitor cells from rats．Mean ± SD．n=7．*P ＜ 0．05 vs sham group;#P ＜0．05 vs CRF group．图1 SDF-1和CXCR4 mRNA在各组大鼠外周血EPCs中的表达

Figure 2．Effects of EPOon protein expression of SDF-1 and CXCR4 in peripheral blood endothelial progenitor cells from rats．Mean ± SD．n=7．*P ＜ 0．05 vs sham group;#P ＜0．05 vs CRF group．图2 SDF-1和CXCR4蛋白在各组大鼠外周血EPCs中的表达

讨 论

EPCs是成熟血管内皮细胞的前体细胞，起源于骨髓的原始细胞。骨髓中的EPCs增殖后进入血液循环，参与血管新生和器官修复。近年的研究发现，刺激骨髓动员EPCs，使循环EPCs数量增加，可能是促进慢性肾脏病修复的一种有效手段［5-6］。EPCs通过自身分化、增殖而形成的新生血管不受原有血管内皮细胞功能的影响，且受损的内皮层可由循环EPCs重生。这一现象为EPCs在肾缺血、缺氧导致进行性肾损害中的治疗作用提供了新的理论依据。慢性肾衰竭患者体内EPCs数量、迁移和融合能力都有所下降［7-8］。外周血 EPCs数量主要决定于骨髓中EPCs的动员，在EPCs动员过程中，EPO是一个重要的细胞因子［9］。但EPCs的动员过程有哪些因素参与目前尚不清楚。

近年的研究表明靶组织中某些与归巢相关的因子表达上调与EPCs的动员与归巢有关［10］。SDF-1是CXC趋化因子家族成员，CXCR4是其特异性受体。有研究表明CXCR4在EPCs表面高度表达［5］。SDF-1通过与 CXCR4结合，促进 CD34+造血干/祖细胞逆SDF-1浓度梯度移行和增殖，抑制CD34+造血干/祖细胞凋亡，诱导新生血管形成［11］。SDF-1还能促进内皮细胞和EPCs的存活与增殖，诱导EPCs的定向迁移并参与新血管形成［12-14］。Yin等［15］发现在动脉损伤后，SDF-1可作为独立因素动员和归巢EPCs参与损伤血管的再内皮化。Kuliszewski等［16］发现在应用通过超声破坏微泡技术联合SDF-1基因质粒转染治疗肌肉缺血动物模型后，移植的EPCs能特异归巢到SDF-1表达的损伤组织。国内近年的研究发现中药当归补血汤可能通过提高循环VEGF和SDF-1水平来促进兔动脉粥样硬化模型外周血EPCs的活性［17］。

近年的研究发现EPOR广泛表达于许多非造血组织细胞中［18］。EPO本身就是一种低氧诱导因子，在低氧和红细胞生成素的协同作用下可诱导EPOR的表达［19］。Lin 等［20］研究证实在低氧条件下，EPO/EPOR可通过增强SDF-1表达，加强干/祖细胞的动员。

综上所述，我们的研究初步表明EPO对慢性肾衰竭大鼠外周血EPCs的动员可能与其上调外周血内皮祖细胞SDF-1及其受体表达有关。

Figure 3．Effects of EPO on mRNA expression of EPO and EPOR in peripheral blood endothelial progenitor cells from rats．Mean ± SD．n=7．*P ＜ 0．05 vs sham group;#P ＜0．05 vs CRF group．图3 EPO和EPOR mRNA在各组大鼠外周血EPCs中的表达

Figure 4．Effects of EPO on protein expression of EPO and EPOR in peripheral blood endothelial progenitor cells from rats．Mean ± SD．n=7．*P ＜ 0．05 vs sham group;#P ＜0．05 vs CRF group．图4 EPO和EPOR蛋白在各组大鼠外周血EPCs中的表达