去胰岛素的乳腺癌干细胞培养及雌激素诱导的作用*

陈琼霞， 李 艳， 邓 昊， 刘丽江△

(1江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室，2江大病理诊断所，湖北武汉430056)

乳腺癌是一种性激素依赖性的肿瘤，大量的研究表明其发生发展与其肿瘤干细胞相关，而雌激素对乳腺癌干细胞的调控作用及其机制尚不明确。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)可能参与了雌激素介导的乳腺癌干细胞生长［1-4］。已有的乳腺癌干细胞体外研究主要选用悬浮培养的方法，通过建立的肿瘤球细胞模型，进行深入的体外研究，但其培养液中因含有胰岛素等成分［4-5］，可能对雌激素在乳腺癌干细胞生长中的研究有所影响。去除上述成分后，肿瘤球细胞能否继续作为乳腺癌体外干细胞研究模型，尚不确切，无文献报道。本研究探讨去除胰岛素的悬浮培养方法，培养乳腺癌肿瘤球细胞，并进一步观察雌激素对干细胞形态的影响及干细胞含量的变化，为深入研究雌激素与乳腺干细胞的研究打下坚实的基础。

材料和方法

1 试剂

17β-雌二醇(17β-estradiol，E2β;Sigma)。抗 βactin抗体、羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP抗体(Santa Cruz Biotechnology)。抗醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)抗体(BD Biosciences)。PerCP-CyTM5．5鼠抗人 CD44抗体 和 CD24抗体(BD Pharmingen)。鼠抗人细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗体和兔抗人CD10抗体(Santa Cruz Biotechnology)。羊抗兔荧光标记抗体Alexa Fluor 488以及羊抗鼠荧光标记抗体Alexa Fluor 555(Invitrogen)。MCF7细胞购于ATCC。

2 方法

2．1 细胞培养 MCF7细胞置于含10%小牛血清的IMEM(improved minimal essential medium)培养基中，并加入1%非必须氨基酸、1%HEPES、1%青－链霉素以及2 g/L牛胰岛素，37℃、5%CO2培养箱中培养。

2．2 肿瘤球细胞(tumorsphere)培养 取对数生长期的MCF7细胞常规消化，以5×106/L的密度接种于超低黏附力6孔板(Corning)，于DMEM/F12培养液(Invitrogen)、1×B-27(Invitrogen)、20μg/L上皮生长因子(Sigma-Aldrich)、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子 (ProSpec)和0．5 mg/L氢化可的松(Sigma)中培养。1周后，搜集细胞并进行鉴定。

2．3 E2β的处理 于上述悬浮培养液中加入10－10mol/L E2β(无水乙醇溶解)处理7 d，未处理组中加入1∶1 000体积无水乙醇作为对照。

2．4 Western bloting检测 使用含1%PMSF的细胞裂解液(Beyotime)提取蛋白。使用BCA蛋白浓度试剂盒(Beyotime)，酶标仪以A620测定蛋白浓度，加入6×loading buffer，混匀煮沸 5 min。45 V电泳 30 min后120 V电泳1 h。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)400 mA 转膜，70 min。5% 脱脂奶粉37℃封闭1 h。Ⅰ抗4℃孵育过夜。Ⅱ抗37℃孵育1 h。ECL显色试剂盒(Beyotime)显影。

2．5 CD44及CD24的检测 使用PBS对消化的单细胞进行洗涤并制成单细胞悬液。用鼠抗人CD44抗体和鼠抗人CD24抗体冰上孵育，30 min后，冷PBS洗涤2次，并用PBS对其进行重悬后，流式细胞仪检测CD44和CD24表达情况。

2．6 免疫荧光检测 肿瘤球细胞培养7 d后，消化接种为贴壁细胞24 h时，行CK18和CD10免疫荧光染色。操作过程严格按照说明书要求进行。

3 统计学处理

用SPSS 12．0统计学软件处理，数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 肿瘤球细胞中干细胞培养结果

1．1 肿瘤细胞球的形态特点 MCF7细胞悬浮培养7 d后，见肿瘤细胞球形成，见图1A、B。瘤细胞球呈葡萄状，由30～60个细胞组成。该细胞球特点与文献描述一致［5-6］，提示肿瘤球细胞培养成功。

1．2 肿瘤球细胞多向分化能力的检测 MCF7肿瘤球细胞消化接种于载玻片，常规培养24 h，免疫荧光方法检测CK18(图1C)和CD10蛋白(图1D)，显示CK18和CD10蛋白均表达阳性，即肿瘤球细胞中含有具有多向分化能力的细胞，提示肿瘤球细胞中含有乳腺癌干细胞。

Figure 1．Inducing MCF7 breast cancer cells formed tumor spheres without insulin．A:tumor cells were botryoidal and consisted of 30 to 60 cells(×100);B:tumor cells were botryoidal(×400);C:immunofluorescence staining showed that the tumorsphere cells were positive for CK18(red， × 100)．D:immunofluorescence staining showed that the tumorsphere cells were positive for CD10(red，×100)．图1 乳腺癌MCF7细胞经去胰岛素悬浮培养形成肿瘤球细胞形态

1．3 肿瘤球细胞干细胞标志物的检测 肿瘤球细胞中CD44+CD24－细胞的含量较贴壁细胞明显增高(P＜0．05)，见图2A;肿瘤球细胞中ALDH1蛋白表达量较贴壁细胞明显升高(P＜0．05)，见图2B;并可以102～103的数量级在裸鼠移植瘤模型中成瘤(结果未提供)，提示肿瘤球细胞中干细胞含量增加。

Figure 2．The stem cell marker expression in MCF7 breast cancer tumor sphere cells．A:FCM analysis showed that CD44+CD24－cells was more in tumorsphere cells than in adherent cells;B:Western blotting analysis showed that the tumorsphere cells expressed ALDH1 more than adherent cells．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs adherent cells．图2 乳腺癌MCF7肿瘤球细胞中干细胞标志物的表达

上述结果显示，经去除胰岛素的悬浮培养方法可以获得MCF7肿瘤球细胞，并且其中含有乳腺癌干细胞，可以使用该细胞模型进行雌激素受体表达阳性的乳腺癌干细胞的相关研究。

2 E2β对肿瘤球细胞的作用

使用10－10mol/L E2β处理MCF7肿瘤球细胞7 d，通过形态学观察发现，E2β处理组的肿瘤球细胞体积增大(40～100μm)，见图3。使用10－10mol/L E2β处理MCF7肿瘤球细胞24 h，CD44+CD24－细胞数量较未处理组明显升高(P＜0．05)，见图4A。肿瘤球细胞中ALDH1蛋白表达量较未处理组明显升高(P＜0．05)，见图4B。结果提示，E2β可提高去除胰岛素的悬浮培养方法所获得的乳腺癌干细胞的含量。

Figure 3．The effect of E2β on the volume of mammosphere of MCF7 cells．图3 E2β对肿瘤球细胞体积的影响

Figure 4．The stem cell marker expression in MCF7 breast cancer tumor sphere cells stimulated by 10 －10 mol/L E2β．A:FCM analysis showed that CD44+CD24－cells was more in tumorsphere cells stimulated by E2βthan in control tumorsphere cells;B:Western blotting analysis showed that the tumorsphere cells stimulated by E2β expressed ALDH1 more than control tumorsphere cells．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs vehicle．图4 E2β10－10 mol/L处理后MCF7肿瘤球细胞中干细胞标志物的表达

讨 论

肿瘤干细胞的特点主要包括:能由非常少量的细胞生成肿瘤、多向分化能力、自我更新能力以及表达干细胞标志物等［7-9］。肿瘤干细胞研究模型的建立多采用悬浮培养的方法以获得肿瘤球细胞，悬浮培养的培养液成分也各有不同，一般均含有胰岛素成分［5-6］。但是，乳腺癌干细胞悬浮培养液中若含有的胰岛素等成分可能对雌激素在乳腺癌干细胞生长中作用的研究有所影响［4-5］。本项研究通过反复实践探索，建立了去除胰岛素的悬浮培养方法，在对乳腺癌细胞系MCF7进行悬浮培养时获得了比较理想的肿瘤球细胞。

CK18是上皮细胞的一种中间丝蛋白，是作为上皮细胞的重要分子标志物被广泛地使用。CD10蛋白是90～110 kD的细胞表面锌依赖肽酶，也称之为中性肽链内切酶，在间叶细胞以及乳腺的肌上皮细胞内表达，可作为间叶分化的分子标志物［10］。ALDH1和CD44分子在乳腺癌干细胞中高表达，是具有乳腺癌干细胞特点的分子标志物［11］。在我们的研究中，经过鉴定，肿瘤球细胞不仅表达上皮细胞标志物(CK18)而且也表达间质细胞的标志物(CD10)，同时还高表达乳腺癌干细胞的标志物(ALDH1和CD44)。其结果提示我们在体外获得了更多的具有肿瘤干细胞特点的细胞，为肿瘤干细胞的实验研究奠定了基础。

近期研究表明，肿瘤干细胞是维持乳腺癌生长的重要因素［12-13］。雌激素在乳腺癌干细胞的生长中所发挥的作用及其机制尚不明确。本研究结果显示，E2β可使肿瘤球细胞体积增大并诱导具有肿瘤干细胞标志的细胞数量增多，提示雌激素具有诱导乳腺癌干细胞的生长能力，但是其机制还有待于进一步的研究。

综上所述，本项研究使用去除胰岛素的悬浮细胞培养方法，成功建立了乳腺癌MCF7的肿瘤干细胞体外研究模型，同时发现E2β可促进乳腺癌干细胞的生长。