外源性胶质细胞源性神经营养因子对慢传输型便秘大鼠肠道传输功能的影响*

张 兴 范一宏 李延玲 吕 宾 张 璐

浙江中医药大学附属第一医院消化科(310006)

慢传输型便秘(slow transit constipation，STC)是一种以结肠动力障碍为主要特点的顽固性便秘。随着现代生活节奏的加快、饮食结构的改变、人口老龄化问题的出现，STC发病率逐年上升，已成为影响人们生活质量的常见疾病之一。吕宾等［1］的研究发现，神经生长因子及其受体在结肠中的异常表达促进肠神经系统神经元细胞凋亡，引起肠壁神经丛病理改变，进而导致结肠动力异常。本研究通过大黄灌胃建立STC大鼠模型，旨在探讨外源性胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)对STC大鼠结肠组织中的GDNF表达及其肠道传输功能的影响。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂、仪器

清洁级Sprague-Dawley大鼠48只，7～8周龄，雌雄各半，体质量180～220 g，由浙江中医药大学动物中心提供。大黄(浙江中医药大学附属第一医院中药房提供);重组人 GDNF(美国 PeproTech公司);兔抗大鼠GDNF多克隆抗体、二抗试剂、浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);细胞图像分析系统(德国Carl Zeiss公司)。

二、实验方法

1.STC动物模型建立:48只大鼠分为对照组(n=22)和模型组(n=26)，模型组大鼠给予大黄灌胃。参照文献［1］和预实验结果，大黄起始剂量为200 mg/kg，以 2 mL 0.9%NaCl溶液稀释为药物混悬液灌胃，第2 d起每天在前1 d的基础上增加200 mg/kg，直至半数大鼠出现稀便，此后维持该剂量直至80%的大鼠稀便消失，再在此基础上每天依次递增200 mg/kg，直至半数大鼠出现稀便，如此循环给药3.5个月，最后一次80%的大鼠稀便消失1周后停止给药。大黄用量为2000 mg/kg时首次出现半数大鼠致泻，大黄最终用量为3200 mg/kg。对照组大鼠同期给予2 mL 0.9%NaCl溶液灌胃。

2.实验分组:造模成功后，模型组大鼠随机分为STC模型组和模型GDNF组，对照组大鼠随机分为正常对照组和GDNF对照组。GDNF对照组和模型GDNF组按每只2 mL/d(10 ng/mL)的剂量经尾静脉注射重组人GDNF，正常对照组和STC模型组按每只2 mL/d的剂量经尾静脉注射0.9%NaCl溶液，连续7 d。

3.墨汁推进实验测定大鼠肠道传输功能:注射GDNF或0.9%NaCl溶液7 d后，大鼠禁食24 h，经口灌入墨汁2 mL，40 min后以3%戊巴比妥钠0.15 mL/100 mg腹腔注射麻醉后处死，立即剖腹取幽门至直肠末段肠道，在无张力情况下测量肠管总长度和黑染肠管长度，计算肠道推进率(黑染肠管长度/肠管总长度×100%)。

4.免疫组化法检测GDNF表达量:大鼠处死后取中上段结肠组织1 cm，采用免疫组化二步法检测结肠组织GDNF表达量，操作按试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。GDNF免疫组化染色阳性物质呈棕黄色颗粒状，定位于细胞质。采用细胞图像分析系统，每张切片选取10个高倍视野(×400)，图像采集后测定阳性染色面积和积分光密度(IOD)值。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

造模过程中，模型组大鼠死亡4只，3只系灌胃不当致死，1只系外伤致死，对照组无大鼠死亡;模型组大鼠体质量增长较对照组大鼠缓慢(见图1)，毛发无光泽，行动迟缓，精神不振，易激惹。造模结束后，模型组大鼠粪便成形，色深，坚硬，少许呈羊粪状，部分成形便软，湿润黏腻，附着于肛门。对照组大鼠粪便成形，色深，软硬适中，无肛门附着。

图1 造模过程中模型组与对照组大鼠体质量增长情况比较

二、肠道大体病理改变

各组大鼠肠道外观无明显差别，肠管无僵硬、变形、狭窄等病变，结肠黏膜无色素沉着。与正常对照组和GDNF对照组相比，STC模型组大鼠肠壁变薄，伸缩功能减弱，恢复自由伸展所需时间明显延长。

三、肠道传输功能

STC模型组肠道推进率与正常对照组和GDNF对照组相比显著降低(P＜0.01)。模型GDNF组肠道推进率与STC模型组相比显著升高(P＜0.01)，与正常对照组和GDNF对照组相比差异无统计学意义(P ＞0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠肠道推进率比较()

表1 各组大鼠肠道推进率比较()

*与正常对照组比较，P ＜0.01;#与 STC 模型组比较，P ＜0.01

四、结肠组织GDNF表达

结肠组织GDNF阳性细胞主要分部于肌间神经丛，少量分部于黏膜下神经丛。STC模型组GDNF阳性面积和IOD值与正常对照组和GDNF对照组相比显著降低(P＜0.01)。模型GDNF组GDNF阳性面积和IOD值与STC模型组相比显著升高(P＜0.01)，与正常对照组和GDNF对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)(见图2、表2)。

表2 各组大鼠结肠组织GDNF表达情况比较()

表2 各组大鼠结肠组织GDNF表达情况比较()

*与正常对照组比较，P＜0.01;#与 STC模型组比较，P ＜0.01

讨 论

STC是由各种因素引起的结肠运动迟缓、粪便传输能力下降的顽固性便秘，以无便意、排便次数减少、腹胀、腹痛等症状为主要临床表现，其结肠动力障碍与肠神经系统异常密切相关［2，3］。临床上大部分STC患者有长期服用大黄、番泻叶、酚酞等接触性泻剂史，因而造成结肠动力障碍，对泻剂反应性下降并产生依赖性，称为“泻剂结肠”［4，5］。研究［6］发现，结肠壁神经丛的病理改变是泻剂结肠的主要病理学基础。大黄是一种传统中药，具有泄下、健胃、清热、解毒等功效。本研究予大鼠大黄灌胃造模3.5个月后，大鼠肠道传输功能明显减弱，STC模型制备成功。

图2 各组大鼠结肠组织GDNF表达情况(免疫组化二步法，×400)

GDNF对神经系统的发育和营养具有重要意义，可促进神经元细胞存活，预防损伤、毒素以及病理性改变导致的神经元细胞退行性病变［7，8］。胃肠道中的GDNF主要分布于黏膜肌层，在结肠组织中的表达水平显著高于其他胃肠道组织，提示GDNF对结肠肌层神经分布以及神经节细胞功能具有重要影响［9］。本研究结果显示，STC模型组和正常对照组大鼠肠壁肌间神经丛中均存在GDNF表达，但STC模型组的GDNF表达显著低于正常对照组，提示长期使用大黄会导致大鼠肠壁组织中的GDNF表达减少，而GDNF表达减少参与了肠神经系统神经元细胞的退化变性，导致结肠动力障碍。本研究中，给予STC模型组大鼠外源性GDNF治疗后，其肠壁组织GDNF表达显著升高，肠道传输功能明显改善，提示外源性GDNF可上调肠壁组织GDNF表达，促进结肠壁神经细胞修复，改善结肠动力。

综上所述，外源性GDNF可明显改善STC大鼠的肠道传输功能，提示其可能用于临床STC患者的治疗。但GDNF作为一种大分子蛋白质，难以透过血脑屏障且易在体内降解，使其临床应用受到限制。寻找促进内源性GDNF释放的有效途径，可能为STC的临床治疗提供新的方法，有待日后深入研究。

1 吕宾，王梅，范一宏，等.大鼠泻剂结肠肠壁神经生长因子及受体表达的研究［J］.中华消化杂志，2004，24(11):684-687.

2 Voderholzer WA，Wiebecke B，Gerum M，et al.Dysplasia of the submucous nerve plexus in slow-transit constipation of adults［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2000，12(7):755-759.

3 Wedel T，Roblick UJ，Ott V，et al.Oligoneuronal hypoganglionosis in patients with idiopathic slow-transit constipation［J］.Dis Colon Rectum，2002，45(1):54-62.

4 Nadal SR，Calore EE，Manzione CR，et al.Effects of long-term administration of Senna occidentalis seeds in the large bowel of rats［J］.Pathol Res Pract，2003，199(11):733-737.

5 孟健，刘宝华，郑仲谨.大鼠“泻剂结肠”模型的动力学研究［J］.重庆医学，2003，32(3):332-333.

6 王梅，吕宾，范一宏，等.刺激性泻剂对大鼠结肠肌间神经丛超微结构的影响［J］.基础医学与临床，2005，25(5):434-436.

7 Peterziel H，Unsicker K，Krieglstein K.TGFbeta induces GDNF responsiveness in neurons by recruitmentof GFRalpha1 to the plasma membrane［J］.J Cell Biol，2002，159(1):157-167.

8 Hsu YC，Lee DC，Chiu IM.Neural stem cells，neural progenitors，and neurotrophic factors［J］.Cell Transplant，2007，16(2):133-150.

9 Wartiovaara K，Salo M，Sainio K，et al.Distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor mRNA in human colon suggests roles for muscularis mucosae in innervation［J］. J Pediatr Surg，1998，33(10):1501-1506.