中国先天性副肌强直一家系致病基因初步研究

桑道乾 谈昕煜 陈静 时鹏 许文芳 陈齐鸣 胡松年

中国先天性副肌强直一家系致病基因初步研究

桑道乾 谈昕煜 陈静 时鹏 许文芳 陈齐鸣 胡松年

目的对收集的中国先天性副肌强直(PC)一家系致病基因进行初步筛查。方法采用测序的方法对中国PC家系的患者和正常人的SCN4A基因24个外显子测序，分析比较中国PC家系的患者和正常人与正常人群的差异。结果未发现该中国PC家系在SCN4A基因24个外显子存在致病突变。结论该中国PC家系的发病与SCN4A基因无关。

先天性副肌强直(paramyotonia congenita，PC)又称为Eulenburg病，是一常染色体显性遗传病，以冷刺激或运动诱发的发作性面、舌、颈和手部肌强直，持续数分至数小时为显著特征，临床罕见。目前多数学者认为是骨骼肌细胞膜上钠通道Ⅳ型α亚单位(alpha subunit type Ⅳ of voltage-gated sodium channel，SCN4A)基因突变所致。本研究收集了中国一家族性先天性副肌强直，调查和分析患者的临床特征，并对其致病基因进行了初步筛查。

1 家系资料

调查该家系3代，有血缘关系者15人，如下图。明确发病者2代4人即：

Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ8和Ⅲ9因年龄小尚不明确是否为患者。Ⅰ1和Ⅰ2因死亡年代久远，无从知晓是否为患者。先证者Ⅱ1，男，60岁，电工。发作性肌肉僵硬三十年入院。三十年前出现双下肢小腿和大腿肌肉僵硬，常在运动后或劳累后发作，发作时持续一到数分钟，数天发作一次。肌肉僵硬逐渐累及腹肌、胸背肌肉、双上肢肌肉、颈部肌肉和咀嚼肌肉。常有张口后不能立刻闭觜，双手长时用力持握老虎钳或冬季骑摩托车不能放松，症状持续约5 min后缓解。同时有夜间起床后不能立即行走，需全身摇晃5～10 min后才能行走。肌肉僵硬冬天较夏天发作频繁。近两月发作加重，一天数次，累及腹肌、胸背肌肉、四肢肌肉、颈部肌肉和咀嚼肌肉。患者2女儿和一弟有类似症状。体检：宽矮体型，四肢肌力和肌张力正常，深反射正常，病理反射未引出，腓肠肌、肱二头肌叩诊未见肌球；右手冰水侵浴10min后见肌肉僵硬发作。辅助检查：电解质结果正常，肌酶谱结果正常；肌电图检查未见强直放电；重复刺激实验未见运动复合电位(compound motor action potential， CMAP)波幅明显衰减；短时运动诱发电位实验可见CMAP波幅即刻轻微衰减，长时运动诱发电位实验可见CMAP波幅延迟轻微衰减，运动后半小时CMAP波幅达最低点，然后缓慢恢复，90分钟后恢复初始波幅。苯妥英钠，0.1g/次，3次/d无效，0.2g/次，3次/d，每天三次有效。

该家系患者共同的临床特征是25岁后发病，寒冷和运动诱发肌肉僵硬，苯妥英钠治疗有效。先证者Ⅱ1特征性的症状是双手长时用力持握老虎钳或冬季骑摩托车不能放松。先证者Ⅱ1的女儿Ⅲ1和Ⅲ2特征性的症状是双手常在冬季洗衣时出现僵硬。先证者Ⅱ1的弟弟Ⅱ5是搬运工，特征性的症状是搬运货物时常出现四肢僵硬。

2 分子遗传学研究

对家系中表型明确的患者和正常人进行SCN4A基因24个外显子测序，分析比较家系中患者和正常人以及正常人群的差异。

2.1DNA提取 采集患者Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ1、Ⅲ2和家系中正常人Ⅱ3、Ⅱ7静脉血2毫升，使用Axygen血基因组DNA小量试剂盒提取DNA。

2.2SCN4A基因24个外显子PCR扩增及测序引物序列如下表。

表1

2.3PCR扩增体系及条件 PCR扩增体系(15μl)： DNA模板1.0μl，10xBuffer(Mg2+) 1.5μl，正向引物(10 mM)0.3μl，负向引物(10 mM)0.3μl， dNTP (2.5 mM)0.4μl，Taq酶 (5U/μl)0.3μl，ddH2O 11.1μl。PCR扩增条件：94°C 预变性3 min，94°C变性 30s，56°C复性30s，72°C 延伸1 min，共32个循环，最后72°C延伸10 min。

2.4AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。

2.5测序反应 (1)测序PCR反应体系(10μl)： 纯化的PCR产物2μl，测序引物NF 1μl，BigDye 2μl，ddH2O 5μl。(2)测序PCR扩增条件：96℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃3Min10s，30个循环。(3)测序反应的纯化后上测序仪ABI 3730XL测序仪测序。

2.6序列变异分析结果 家系中正常人和患者SCN4A基因的第10外显子的变异位点为第118位核苷酸由腺嘌呤核苷酸变异为鸟嘌呤核苷酸，导致其所编码的氨基酸由Ser(丝氨酸)变为Gly(甘氨酸)，单核苷酸多态(SNP)编号为rs6504191，该核苷酸位于转录本NM000334的第1647位。家系中正常人和患者SCN4A基因的其他外显子未发现变异。

3 讨论

PC的显著症状是寒冷或运动诱发的骨骼肌强直，与先天性肌强直不同的是PC无运动后强直缓解所谓温热现象(warm-up phenomenon)。诊断PC主要依靠临床特征[1]。肌强直放电有助于诊断，但肌强直放电受温度影响。当温度低于28°C时，肌电图检查会出现纤颤电位；当温度低于20°C时，肌强直性放电消失[2]。有些患者，室温下肌电图检查可完全正常[3]。因此，依靠肌电图所见肌强直放电诊断PC不可靠。本家系肌电图检查未出现肌强直性放电可能是检查条件限制所致。本家系临床特征符合PC诊断条件，短时和长时运动诱发肌电图也支持诊断。

目前对于PC的分子遗传学研究文献报道集中于SCN4A基因，该基因位于17q23-q25.3。Park JH等报道一韩国PC家系患者的致病突变位点为SCN4A G1306V[4]。Koch MC等[5]报道一德国PC家系患者的致病突变位点为SCN4A Val1293Ile。然而Schose BGH等[6]对另一德国4代17例患者的PC大家系研究发现致病位点是SCN4AA1481D。Davies NP等[7]研究发现一爱尔兰PC家系的致病突变是SCN4AG4367A。Sallansonnet-Froment M等[8]报道法国一PC家系的致病位点在SCN4AArg1448Cys。Kinoshita M等[9]报道日本一PC家系的致病位点在SCN4A Thrl313Met。Parasivam S等[10]发现澳大利亚PC家系的致病位点在SCN4AT1313。Feng Y等[11]研究发现中国伴有周期性麻痹的PC家系的突变位点在SCN4AMet1592Val。Matthew E等[12]对来自英国的42例PC患者，其中包括28例有血缘关系的PC患者进行研究，结果发现R1448L 和L1436P两个新的致病位点，同时也发现10例(包括8例有血缘关系)PC无SCN4A无突变。Sampaolo S等[13]报道一意大利PC家系的SCN4A基因既无突变也无异常剪切。由此可见，PC存在遗传异质性。本研究对SCN4A基因的24个外显子测序未发现致病突变，初步排除了SCN4A基因为该中国PC家系的致病基因。该中国PC家系的致病基因有待进一步研究。

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PreliminarystudyofcausativegeneforaChinesefamilyparamyotoniacongenital

SANGDao-qian,TANXin-yu,CHENJing,etal.

DepartmentofNeurology,TthefirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,AnhuiBengbu233004,China

ObjectiveTo study the causative gene in a Chinese family paramyotonia congenital(FPC).MethodsDNA sequencing analysis for exons of alpha subunit type Ⅳ of voltage-gated sodium channel (SCN4A) was conducted between affected and normal individuals of the Chinese FPC and other normal people, each other.ResultsUnexpectly, no causative mutation for the Chinese FPC was found in SCN4A.Conclusionthe Chinese FPC has no relationship with SCN4A.

233004 蚌埠医学院第一附属医院神经内科(桑道乾 陈静 时鹏 许文芳 陈齐鸣)；中国科学院北京基因组研究所(谈昕煜 胡松年)