高迁移率族蛋白B1单抗对急性坏死性胰腺炎小鼠的保护作用及其机制研究

夏敏 张婷 郭继中 陈卫昌

·短篇论著·

高迁移率族蛋白B1单抗对急性坏死性胰腺炎小鼠的保护作用及其机制研究

夏敏 张婷 郭继中 陈卫昌

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box chromosomal protein 1, HMGB1)是一类广泛存在于真核细胞内的非组核蛋白，它通过结合晚期糖基化终端产物受体(receptor for advanced glycated end-products，RAGE)及Toll样受体(toll-like receptor，TLR)家族成员TLR2和TLR4进行信号转导，诱导NF-κB核移位，触发炎症反应[1]。HMGB1作为晚期炎症因子参与了急性胰腺炎的全身炎症反应[2]。本研究应用HMGB1单抗干预急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)小鼠，探讨其保护机制。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：雄性ICR(Institute for Cancer Research)小鼠108只，体重20～25 g，由江苏省血吸虫病防治研究所动物房提供。按随机表法分为正常对照组、ANP组和HMGB1单抗处理组(HMGB1)。参照文献[3]，采用腹腔注射20%L-精氨酸(200 mg/100 g体重)2次、间隔1 h的方法制备ANP模型。HMGB1组于制模24 h后腹腔内注射HMGB1单抗200 μg[4]，正常对照组及ANP组大鼠腹腔注射等容积无菌生理盐水。注射后12、24、48 h分批处死大鼠，取血和新鲜胰腺组织。

2．血清HMGB1浓度测定：采用ELISA法。试剂盒购自日本SHINO-TEST公司，严格按说明书操作。

3．胰腺组织HMGB1 mRNA表达检测：应用Trizol提取小鼠胰腺组织RNA，逆转录合成cDNA，实时荧光定量PCR法检测HMGB1 mRNA的表达，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参。HMGB1引物序列上游5′-ACAGCCATTGCAGTACATTGAG-3′，下游5′-TTGCCCATGTTTAGTTGATTTTCC-3′，荧光探针序列：5′-(FAM)AGAGTCGCCCAGTGCCCGTCCG (Eclipse)-3′，扩增片段113 bp。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、58℃ 30 s，40个循环，最后72℃延伸1 min。采用LightCycler荧光定量PCR仪，通过仪器自带软件记录循环周期数(crossing point，CP)，计算△CP值，表示mRNA表达量。

4．细胞凋亡及坏死测定：将新鲜胰腺组织制成匀浆，应用Annexin V/PI双染色法在流式细胞仪上检测细胞凋亡及坏死。

5．胰腺组织NF-κB蛋白表达检测：采用常规免疫组化法检测NF-κB的表达。应用Tiger 920图像分析软件扫描计算阳性面积的积分光吸收值和平均光吸收值作为蛋白的表达量。

二、结果

1．小鼠血清HMGB1浓度的变化：ANP组小鼠血清HMGB1浓度显著高于正常对照组，HMGB1组显著低于ANP组(表1)。

表1 3组小鼠血清 HMGB1浓度的变化

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与ANP组比较，bP<0.05

2．小鼠胰腺组织HMGB1 mRNA表达的变化： ANP组小鼠胰腺组织HMGB1 mRNA表达显著高于正常对照组，HMGB1组的表达显著低于ANP组，但仍显著高于正常对照组(表2)。

表2 3组小鼠胰腺组织 HMGB1 mRNA 表达

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与ANP组比较，bP<0.05

3．小鼠胰腺细胞凋亡和坏死率的变化：ANP组小鼠胰腺细胞坏死率显著高于正常对照组，而凋亡率显著低于正常对照组；HMGB1组小鼠胰腺细胞坏死率较ANP组显著减少，而凋亡率显著增加(表3，图1)。

表3 3组小鼠胰腺细胞的凋亡率及坏死率比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与ANP组比较，bP<0.05

图1对照组(a)、ANP组(b)、HMGB1组(c)胰腺细胞的凋亡(上，24 h)和坏死(下，48 h)

4．小鼠胰腺组织NF-κB表达的变化：对照组、ANP、HMGB1组小鼠胰腺组织在48 h时的NF-κB表达量分别为88.93±2.07、295.16±20.76、81.11±9.02(图2)。ANP组显著高于对照组(P<0.05)；HMGB1组显著低于ANP组(P<0.05)，而与对照组的差异无统计学意义。运用线性回归统计学分析，ANP组小鼠48 h时的血清HMGB1浓度与胰腺NF-κB表达水平呈线性正相关(r=0.883，P<0.05，图3)。

图2对照组(a)、ANP组(b)、HMGB1组(c)胰腺组织NF-κB表达(免疫组化 ×400)

图3 建模后48 h血清HMGB1浓度与NF-κB表达的相关性

讨论重症急性胰腺炎时炎性细胞因子的大量释放可导致全身炎症反应综合征(SIRS)，并进一步恶化发展为多器官功能障碍综合征(MODS)、多器官功能衰竭(MOF)。早期释放的炎症因子如TNF-α和IL-1β等均在发病后迅速升高至峰值，随即迅速下降，但炎症反应和脏器损害仍在继续，提示可能有某些晚期炎症因子参与了病理过程。近年来大量研究结果表明，HMGB1可能作为重要的晚期炎症递质参与急性胰腺炎的全身炎症反应。本研究采用腹腔内注射L-精氨酸制作小鼠ANP模型，结果显示血清HMGB1水平在建模后12 h开始明显升高，24 h至高峰，48 h仍维持在较高水平；胰腺组织HMGB1 mRNA表达水平在建模后12 h开始升高，24 h显著升高。ANP时小鼠血清HMGB1浓度的升高可能有两方面的机制，首先ANP时炎性因子过度激活，激活的巨嗜细胞/单核细胞主动分泌HMGB1，其次与ANP时受损的器官产生和释放HMGB1有关。给予HMGB1单抗干预后胰腺组织HMGB1 mRNA表达水平明显下降，血清HMGB1浓度也明显下降。

细胞凋亡已被证实在许多生物过程中起着重要的调节作用，包括炎症反应。内毒素、烧伤、缺血等均可导致相关脏器的细胞凋亡。1995年Kaise等[5]报道，ANP大鼠胰腺见大量坏死细胞，凋亡细胞少见；而急性水肿型胰腺炎(AEP)大鼠胰腺见大量凋亡细胞，坏死细胞少见。作者认为凋亡细胞对腺泡细胞的保护作用阻止了AEP向ANP的发展。Saluja等[6]的动物实验也证实了相似的结论，预先诱发细胞凋亡能防止胰腺腺泡的损伤，减少ANP的发生。本实验结果显示，ANP小鼠胰腺腺泡细胞坏死率较对照组显著增高，凋亡率明显降低，HMGB1单抗抑制HMGB1表达后胰腺坏死率显著降低，凋亡率增高，表明HMGB1的表达与凋亡逃逸有关。凋亡细胞不释放HMGB1，不会触发炎症反应；相反，坏死细胞HMGB1松散地结合在分裂间期和分裂期的细胞核上，当细胞坏死、细胞膜通透性升高、细胞膜的完整性破坏后，HMGB1很快就泄漏至细胞外。HMGB1作为一种内源性危险信号提醒机体免疫系统警觉坏死细胞的存在，适度的细胞凋亡对ANP时胰腺腺胞细胞可能具有保护作用。

HMGB1通过与细胞表面不同受体例如晚期糖基化终端产物受体RAGE、Toll样受体家族TLR2和TLR4相结合启动炎症反应[7]，与这些受体结合后可导致NF-κB信号途径激活，促进炎症介质TNF-α、IL-6、INF-γ的产生[8]。有作者认为，NF-κB的激活对AP的发生、发展和持续恶化起了非常关键的作用[9]。本研究结果显示，NF-κB的表达与ANP小鼠HMGB1血清浓度呈正相关；HMGB1单抗抑制血清HMGB1水平的同时可降低NF-κB的浓度，提示HMGB1可能通过激活NF-κB信号转导途径介导炎症反应。因此通过各种途径下调血清HMGB1水平或拮抗其作用，阻断炎症瀑布反应是临床防治重症急性胰腺炎的关键。

[1] Park JS, Svetkauskaite D, He Q, et al. Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein. J Biol Chem, 2004, 279: 7370-7377.

[2] Yasuda T, Ueda T, Shinzeki M, et al. Increase of high-mobolity group box chromosomal protein 1 in blood and injured organs in experimental severe acutepancreatitis. Pancreas, 2007, 34:487-488.

[3] 赵秋玲，黄承钰，徐家玉,等.L-精氨酸诱导小鼠急性坏死性胰腺炎模型的建立.疾病控制杂志,2004, 8:141-143.

[4] Sawa H, Ueda T, Takeyama Y, et al. Blockade of high mobility group box-1 protein attenuates experimental severe acute pancreatits. World J Gastroenterol, 2006, 12: 7666-7670.

[5] Kaiser AM, Saluja AK, Sengupta A, et al. Relationship between severity, necrosis and apoptosis in five models of experimental acute pancreatitis. Am J Physiol, 1995, 269:c1295-c1304.

[6] Saluja A, Hofbauer B, Yamaguchi Y, et al. Induction of apoptosis reduces the severity of caerulein-induced pancreatitis in mice. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 220:875-878.

[7] Lotze MT,Tracey KJ. High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol, 2005, 5:331-342.

[8] Yang H, Tracey KJ. Targeting HMGB1 in inflammation. Biochim Biophys Acta, 2010, 1799:149-156.

[9] Rakonczay Z Jr, Hegyi P, Takacs T, et al. The role of NF-kB activation in the pathogenesis of acute pancreatitis. Gut, 2008, 57:259-267.

2012-08-09)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.019

214023 无锡，南京医科大学附属无锡人民医院消化科(夏敏、郭继中)；江苏省中医院消化科(张婷)；苏州大学附属第一医院消化科(陈卫昌)

夏敏，Email:xmzb11013@163.com