胰腺癌细胞株Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变的相关性研究

胡佳佳 吴红玉 金晶 朱春平 李兆申 高军 李淑德

·论著·

胰腺癌细胞株Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变的相关性研究

胡佳佳 吴红玉 金晶 朱春平 李兆申 高军 李淑德

目的探讨胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变的相关性。方法采用实时定量PCR法检测人胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988、CFPAC-1、PANC1、AsPC-1、Capanc-2、BxPC-3的K-ras基因突变状况及Hedgehog信号通路主要成员Gli1、Smo mRNA的相对表达量。结果PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988细胞为12密码子突变型，SW1990细胞为13密码子突变型，BxPC-3、Capanc-2细胞为纯野生型。AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Gli1 mRNA相对表达量分别为7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相对表达量分别为144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03。K-ras基因野生型胰腺癌细胞Gli1、Smo mRNA的表达水平均较突变型胰腺癌细胞株显著降低，其中野生型BxPC-3细胞Gli1、Smo mRNA表达量显著低于突变型AxPC-1细胞(P值均<0.05)。结论胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变具有相关性。

胰腺肿瘤； K-ras； 点突变； Hedgehog信号通路； 转录因子

胰腺癌的发生、发展是个多种基因共同参与的多步骤、多阶段过程。该过程中参与调控细胞增殖、分化、凋亡的多种基因发生异常改变，如原癌基因K-ras的点突变等，均与胰腺癌的发生、发展密切相关。此外，胰腺癌的发生亦与多种信号转导通路的异常相关，如EGFR信号通路、Hedgehog信号通路、Smad4/TGF-β信号通路、Notch信号通路等。近年来的研究证实，Hedgehog信号通路活化是胰腺癌干细胞生存的前提，被认为是胰腺癌的核心致病机制之一[1-2]。本研究观察人胰腺癌细胞株的K-ras基因突变情况及Hedgehog信号通路活化状况，探讨两者在胰腺癌发生、发展中的相关性及相互作用。

材料和方法

一、K-ras基因突变检测

人胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC-3、 AsPC-1、 Capanc-2、 PaTu8988、SW1990均购自中国科学院细胞所，常规培养、传代。收集对数生长期细胞，应用酚-氯仿法抽提胰腺癌细胞DNA，使用NanoDrop核酸微量测量仪(ND1000型)测定DNA浓度，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水调整浓度至50 ng/μl。K-ras基因上、下游引物，K-ras-FAM Tagman MGB探针，K-ras-VIC Tagman MGB探针均由美国AppliedBiosystems公司合成；肽核酸(PNA)由韩国Panagene公司合成。采用实时PCR法检测K-ras基因突变。总K-ras基因检测反应体系：Master Mix 7.5 μl，引物1.5 μl，MGB探针1 μl，DEPC水2.5 μl，模板2.5 μl。K-ras基因第12、13密码子检测反应体系：Master Mix 7.5 μl，引物1.5 μl，PNA2.5 μl，MGB探针1 μl，模板2.5 μl。每个样品设置3个复孔，分别检测K-ras基因第12、13密码子突变及总K-ras基因。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、70℃ 10 s、55℃ 5 s、72℃ 32 s，50个循环。

二、Gli1、Smo mRNA表达检测

应用Trizol抽提胰腺癌细胞总RNA，使用NanoDrop核酸微量测量仪(ND1000型)测定mRNA浓度。Gli1、Smo及内参GAPDH Taqman探针、引物均由美国Invitrogen公司设计合成。应用Takara公司的反转录试剂盒逆转录合成Gli1、Smo 的cDNA。PCR反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，50个循环。通过PCR仪自带软件获取ΔCt值，mRNA表达量用公式2-ΔΔCt计算。实验重复3次，取均值。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌细胞株K-ras基因的突变状态

PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988细胞为12密码子突变型，SW1990细胞为13密码子突变型，BxPC-3、Capanc-2细胞为纯野生型(图1)。

图1 7株胰腺癌细胞株K-ras基因的PCR扩增曲线

二、 胰腺癌细胞株Gli1、Smo mRNA的表达

AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Gli1 mRNA相对表达量分别为7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相对表达量分别为144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03，其中K-ras基因野生型细胞株BxPC-3的Gli1、Smo mRNA表达水平均显著低于K-ras基因突变型细胞株AsPC-1(P值均<0.05)。

三、K-ras基因野生型与突变型细胞株Gli1、Smo mRNA的表达差异

K-ras基因野生型胰腺癌BxPC-3、Capanc-2细胞的Gli1、Smo mRNA的表达水平较突变型胰腺癌细胞株显著降低(P值均<0.05，图2)。其中野生型BxPC-3细胞的Gli1、Smo mRNA表达与突变型AsPC-1细胞的差异最显著。

图2K-ras基因野生型与突变型胰腺癌细胞株Gli1(上)、Smo mRNA(下)表达量的比较

讨 论

Hedgehog信号通路以组织特异的方式控制细胞的增殖及分化，在胚胎的正常发育中发挥重要作用，在正常成熟胰腺中不表达或仅轻度表达[3]。近年来研究发现，多种人类恶性肿瘤的发生、发展与Hedgehog信号通路的异常调控密切相关，如基底细胞癌、小细胞肺癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌等[4-5]。Ji等[6]研究认为，癌基因K-ras突变导致胰腺癌发生的机制部分是通过激活Hedgehog信号通路来实现的。Xu等[7]认为，Hedgehog信号通路配体Shh可以通过增强K-ras癌基因的活性诱导胰腺癌发生，降低肿瘤细胞对持续性激活的Ras信号通路的依赖性。Pasea di Magliano等[8]采用一种可特异性激活胰腺上皮细胞中Hedgehog信号通路的小鼠模型研究胰腺癌的发病机制，结果发现小鼠生长到成年后可形成胰腺未分化癌，激活Ras信号通路可进一步导致广泛性胰腺上皮内瘤变并提高肿瘤致死性，提示特异性激活胰腺上皮细胞中Hedgehog信号通路可以诱导胰腺瘤变，Ras和Hedgehog信号通路共同参与胰腺导管腺癌的形成。此外，Morton等[9]研究发现，由K-ras和Hedgehog联合诱导的肿瘤细胞株在应用Hedgehog信号通路拮抗剂后，尽管信号通路被抑制，而肿瘤细胞仍可继续增殖。因此深入探讨胰腺癌发生分子机制中的Hdgehog信号通路与其他信号通路之间的相互作用成为研究的热点。本研究检测了7株胰腺癌细胞株的K-ras基因突变状况及Hedgehog信号通路主要成员Gli1、Smo mRNA的表达，结果显示K-ras基因野生型胰腺癌细胞株Gli1、Smo mRNA的表达水平较突变型胰腺癌细胞株显著降低，其中野生型BxPC-3细胞的Gli1、Smo mRNA表达水平与突变型AsPC-1细胞的差异最显著，提示Gli及Smo基因表达与K-ras基因突变在胰腺癌发生、发展过程中具有相关性。

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ThestudyonthecorrelationofactivationoftheHedgehogsignalingpathwayandK-rasgenemutationsinpancreaticcancercelllines

HUJia-jia,WUHong-yu,JINJing,ZHUChun-ping,LIZhao-shen,GAOJun,LIShu-de.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LIShu-de,Email:lishude57@126.com;GAOJun,Email:gaojunaaa@gmail.com

ObjectiveTo investigate the correlation of K-ras gene mutations and activation of Hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer cell lines.MethodsReal-time PCR was used to detect K-ras gene mutations at codon 12 and 13 in pancreatic cancer cell lines of SW1990, PaTu8988, CFPAC-1, PANC1, AsPC-1, Capanc-2, BxPC-3 and the mRNA expression of Gli1, Smo in these cell lines.ResultsThe K-ras mutation of PANC1, CFPAC-1, AsPC-1, PaTu8988 was at codon 12, while SW1990 was at codon 13, BxPC-3, Capanc-2 were wild type. The expressions of Gli1 mRNA of AsPC-1, CFPAC-1, PANC1, PaTu8988, SW1990, BxPC-3, Capanc-2 were 7.84±8.92, 1.82±3.45, 1.00±0.00, 0.07±0.10, 0.88±1.48, 0.52±0.98, 0.15±0.19, and the expressions of Smo mRNA were 144.00±58.33, 3.48±3.77, 1.00±0.00, 81.68±28.26, 0.72±0.87, 0.34±0.60, 0.02±0.03. Gli1, Smo mRNA expressions of cells with wild tpye K-ras were significantly lower than those with mutant type, and wild type BxPC-3′s Gli1, Smo mRNA expressions were significantly lower than that of mutant AxPC-1 (P<0.05).ConclusionsActivation of Hedgehog signaling pathway may be related to K-ras gene mutations.

Pancreatic neoplasms; K-ras; Point mutation; Hedgehog signaling pathway; Transcription factor

2013-06-03)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.012

重大国际合作项目(30910103911)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李淑德，Email：lishude57@126.com；高军，Email：gaojunaaa@gmail.com