人胰腺癌编码SUFU蛋白的新剪接体

徐清 满晓华 高军 李兆申 龚燕芳 吴红玉 金晶

·论著·

人胰腺癌编码SUFU蛋白的新剪接体

徐清 满晓华 高军 李兆申 龚燕芳 吴红玉 金晶

目的分析人胰腺癌组织和细胞中Hedgehog信号通路主要成员SUFU蛋白的剪接体。方法用反转录和3′cDNA末端快速扩增(3′RACE)法扩增suppresser of fused(SUFU)片段，测序发现一个新的外显子，应用RT-PCR方法扩增全长含新外显子的SUFU(nSUFU)。采用脂质体法将nSUFU及SUFU转染SW1990细胞，应用蛋白质印迹法检测SW1990细胞及胰腺癌组织新剪接体编码的蛋白质的表达。结果通过3′RACE法的第二轮巢式PCR扩增产物约600 bp，经测序并将其序列与NCBI网站Blast序列对比分析发现，在SUFU mRNA isoform1(NM_016169.3)的第10外显子和第11外显子之间插入了一个长为126 bp的新外显子。通过对SW1990细胞的验证，包含新外显子的完整的新剪接体片段长约1400 bp。转染nSUFU的SW1990细胞强表达nSUFU蛋白，胰腺癌组织既表达SUFU蛋白，又表达nSUFU 蛋白。结论人类胰腺癌组织和细胞中存在一种新的可以编码SUFU蛋白的剪接体。

胰腺肿瘤； Hedgehog信号通路； 剪接体； SUFU

Hedgehog信号通路的激活是胰腺癌的核心致病机制之一。脊椎动物中Hedgehog信号通路包括配体hedgehog，靶细胞表面受体Ptch1、Smo和下游的核转录因子Gli等，其中suppresser of fused(SUFU)可以调节Gli的活性，是Hedgehog的关键负调控因子。然而，正常的Hedgehog通路中一些细节却并不明确，而且肿瘤中Hedgehog信号通路各成员以及它们与其他分子的相互作用也会发生变化，因此，这些问题成为科学家们关注和研究的热点。本研究在扩增SUFU mRNA的过程中发现了一种新的可以编码蛋白的SUFU剪接体(nSUFU)，在NCBI以及ensmbl等网站上还没有被公布过。现报道如下。

材料与方法

一、材料

人胰腺癌细胞株SW1990由长海医院消化内科实验室保存，RNA iso Plus购自TaKaRa公司，3′RACE core set试剂盒购自TaKaRa公司，pcDNA3.1mychisA(+)表达载体购自invitrogen公司，SUFU(NM_016169.3)表达载体购自复能基因公司，兔抗人SUFU一抗(产品分类号：NBP1-40515)购自美国Novus biologicals公司，内参GAPDH一抗购自Abmart公司，HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自Abmart公司，飞克级ECL化学发光检测试剂盒购自Thermo公司，人胰腺癌组织来自长海医院外科手术切除的标本。

二、方法

1．SW1990细胞总RNA抽提：细胞常规培养、传代。取对数生长期细胞，经胰酶消化、离心收集细胞，用PBS洗涤后，加入200 μl RNA iso Plus，立刻吹散溶解细胞，加入40 μl三氯甲烷，混合均匀，4℃ 12 000 r/min离心10 min。将上清转移到另一个新管中，加入70 μl无水乙醇，-20℃沉淀RNA 30 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min。吸除上清，用DEPC处理水配置的70%乙醇100 μl洗涤沉淀2次，4℃离心10 min，吸除上清后开盖室温放置5 min使乙醇挥发，加入适量DEPC处理水溶解RNA沉淀。

2．cDNA末端快速扩增法(3′ rapid amplification of cDNA ends, 3′RACE)：3′RACE core set试剂盒内有可以结合成熟mRNA polyA序列的adaptor反转录引物、M-MLV反转录酶、第一轮巢式PCR的反向引物(outer primer)和第二轮巢式PCR的反向引物(inner primer)。先行反转录。将1 μl带有polyA序列的胰腺癌SW1990细胞的RNA(500 ng/μl)和1 μl adaptor置70℃变性10 min，然后加M-MLV反转录酶0.25 μl、RNase Inhibitor 0.25 μl、5×M-MLV Buffer 2 μl、dNTP Mixture 1 μl、RNase Free dH2O 4.5 μl。以试剂盒自带的HL60细胞总RNA作为对照。反应条件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。然后行两轮巢式PCR(图1)。

第一轮巢式PCR反应的正向基因特异性引物1(gene specific primer 1，GSP1)序列自行设计，为5′-CGCAAAGACAGCCTGGAAAGTGAC-3′， 在NM_016169.3的第9外显子中，第一个碱基的位置在第1218核苷酸处。反向引物outer primer为3′RACE试剂盒自带。PCR反应体系：上述逆转录反应液3 μl，1×cDNA Dilution BufferⅡ 7 μl，GSP1(10 μmol/L)2 μl，outer primer 2 μl, 10×Ex Taq Buffer(含Mg2+)5 μl，Ex Taq 0.25 μl，dH2O 30.75 μl。以试剂盒自带的3′RACE control outer primer替代GSP1作为对照。反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 5 min，25个循环，72℃延伸10 min。

图1 3′RACE巢式PCR扩增SUFU 3′UTR示意图

第二轮巢式PCR反应的正向GSP2序列为5′-TCCTGCATGGACGGCACTTTAC-3′，在NM_016169.3的第10外显子中，第一个碱基的位置在第1357核苷酸处。反向引物inner primer为3′RACE试剂盒自带。PCR反应体系：第一轮PCR产物1 μl，dNTP Mixture 8 μl，10×Ex Taq Buffer(加Mg2+)5 μl，Ex Taq 0.5 μl，GSP2(10 umol/L)2 μl，inner primer 2 μl，dH2O 31.5 μl。以试剂盒自带的3′RACE control outer primer替代GSP2作为对照。反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 5 min，30个循环，72℃延伸10 min。第二次PCR扩增产物大小约为600 bp，送invitrogen公司测序，发现一个新外显子。

3．新外显子的验证：抽取胰腺癌SW1990细胞总RNA，用SUFU开放读码框反向引物(序列为5′ -CTAGTGTAGCGGACTGTCGAACA-3′)以及M-MLV反转录酶反转录成cDNA，再使用SUFU第1外显子的正向引物(序列为5′-CTCCAGGTTACCGCTATCGTC-3′)和SUFU新外显子的3′反向引物(序列为5′-TTCGGTCAACAGAATCAGGTTTC-3′)进行PCR扩增(图2)，扩增产物1400 bp左右。

图2 RT-PCR扩增完整的SUFU新剪接体示意图

4．全基因SUFU合成以及表达载体的构建：由上海翰宇生物公司合成含新外显子的新SUFU(nSUFU)的全基因，合成时在nSUFU序列前加上保护碱基CG、BamHI酶切位点GGATCC和为了满足kozac序列表达需要的碱基GGG，在nSUFU序列尾部去除终止密码子TGA，加上Age Ⅰ酶切位点ACCGGT和保护碱基GCGC。通过Bam HI和Age Ⅰ双酶切和DNA连接酶将nSUFU 插入pcDNA3.1mychisA(+)表达质粒，表达的nSUFU蛋白融合有His标签。

5．细胞转染以及蛋白质印迹法检测：用6孔板常规培养SW1990细胞，待细胞生长到80%融合时，采用脂质体法将nSUFU及SUFU表达质粒分别转染SW1990细胞。收集转染后的胰腺癌细胞以及胰腺癌组织，制备细胞或组织匀浆，采用蛋白质印迹法检测细胞、组织的nSUFU及SUFU蛋白的表达。最后ECL化学发光、摄影获得发光图像。

结 果

一、SUFU新外显子的分析及验证

第二轮巢式PCR扩增产物约600 bp(图3)。测序获得的序列经过与NCBI网站Blast序列对比分析发现，在SUFUmRNA isoform1(NM_016169.3)的第10外显子和第11外显子之间插入了一个长为126 bp的新外显子，新外显子的序列为AGACCT-CCGTCCTGTGAGCTCCCGAGCCGTCCTGTGTGCTCA-CCTTCCTGTGTGCACTCCTTCCTTGTTATCTCACACG-GTGGAAACTTTTGTTCTTGGCAGCTGACAATTCCCA-GGGGAAACCTG(图4)。通过对SW1990细胞的验证，包含新外显子的nSUFU完整剪接体的片段长约1400 bp(图5)。含新外显子的nSUFU剪接体与文献报道的SUFU剪接体的比较见图6。

图3 第二轮巢式PCR扩增产物的电泳图

图4 巢式PCR扩增产物的测序图

图5 完整的包含新外显子的剪接体nSUFUA的电泳图

第10外显子之前各剪接体外显子相同，箭头所指的是新发现的外显子，数字表示的是外显子所在染色体上的碱基位置

图6nSUFU与其他SUFU剪接体的比较

二、SW1990细胞及胰腺癌组织nSUFU蛋白的表达

SW1990细胞低表达SUFU蛋白，转染SUFU的SW1990细胞SUFU蛋白表达上调，转染nSUFU的SW1990细胞强表达nSUFU蛋白。胰腺癌组织既表达SUFU蛋白，也表达nSUFU 蛋白(图7)。

图7SW1990细胞(1)、转染SUFU的SW1990细胞(2)、转染nSUFU的SW11990细胞(3)及胰腺癌组织(4)的SUFU和nSUFU蛋白的表达

讨 论

胰腺癌的发病机制与多种信号转导通路的激活有关，这些信号的激活部分是某些分子的基因突变导致的，比如K-ras的突变[1-2]。Hedgehog信号通路的激活是胰腺癌发病的核心致病机制之一[3-4]，其他与胰腺癌发病相关的通路有EGFR[5-8]、Notch[9-10]、凋亡信号通路等。Hedgehog在胰腺癌中的作用包括Hedgehog配体以自分泌和旁分泌的方式激活胰腺上皮细胞的生长，促进胰腺间质结缔组织增生[11]，促进上皮间质转化(EMT)从而导致远处转移[12]。然而，Hedgehog通路各主要分子成员的相互作用还有待深入研究。

Hedgehog通路的配体Shh、Ihh、Dhh与跨膜受体Ptch结合，解除了它对Smo的抑制，Smo通过作用于SUFU，从而释放Gli家族转录因子转位到细胞核，激活Hedgehog靶基因。

本实验室前期的研究结果显示，Hedgehog主要负调控因子SUFU在人胰腺癌组织中表达明显增加[13]，与Hedgehog信号通路在胰腺癌组织中被激活的观点似乎有矛盾，因此继续深入研究SUFU分子尤为重要。本研究发现了一个新的SUFU剪接体(nSUFU)，它包含了一个新的外显子，并且此剪接体在人胰腺癌组织中可以编码相应的新的SUFU蛋白。剪接体的多样性是生物体实现功能多样性的机制之一，不同剪接体编码不同蛋白质，从而发挥不同的功能。最新研究结果显示，某些蛋白质的错误剪接体会导致肿瘤的发生。本研究新发现的nSUFU蛋白到底在胰腺癌的发生、发展中起到什么样的作用，是否在Gli活性形式的转换中发挥不同于其他剪接体的作用还有待进一步研究。

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Anovelspliceosomeencodingisoformofsuppresseroffusedinhumanpancreaticcancer

XUQing,MANXiao-hua,GAOJun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,WUHong-yu,JINJing.

Departmentofgastroenterology,ChanghaiHospital,SecondmilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:GAOJun,Emai:gaojunaaa@gmail.com,LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate spliceosome of suppresser of fused(SUFU), a major member of hedgehog signaling pathway in human pancreatic cancer.MethodsSUFU fragment was amplified by using reverse transcription and 3′RACE. After sequencing, a new exon was discovered, and then nSUFU was amplified by RT-PCR. nSUFU and SUFU were transfected into SW1990 by liposomes, and then the expressions of SUFU protein encoded by new spliceosome in SW1990 cells and pancreatic cancer tissues were detected by Western blot.ResultsPCR products by 3′RACE were of 600 bp, after sequencing and comparison with Blast data of NCBI, it was detected that a new exon was inserted between SUFU mRNA isoform1 (NM_016169.3) exon 10 and exon 11. After verification with SW1990, it was noted the entire new spliceosome containing new exon was of 1400 bp. SW1990 with nSUFU transfection strongly expressed nSUFU protein, and pancreatic cancer tissues expressed both SUFU and nSUFU protein.ConclusionsA new spliceosome of SUFU, which can encode SUFU protein, is present in pancreatic cancer tissue and cell.

Pancreatic neoplasms; Hedgehog signaling pathway; Spliceosomes; SUFU

2013-01-11)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.005

国家自然科学基金(30910103911，81272663)；上海市重点科技攻关项目(11441901800)；国家科技支撑计划(2006BAI02A12)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

共同第一作者：满晓华

高军, Emai: gaojunaaa@gmail.com, 李兆申,Email:zhsli@81890.net